苦瓜MAP30基因的克隆表达及对BGC823细胞形态的影响

　　　　作者：黄河 邵世和， 韩晓红， 田树伟 韩军1， 黄世腾

【摘要】 目的： 克隆苦瓜蛋白MAP30基因，并在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，初步研究MAP30蛋白对BGC823细胞的影响。方法: 应用PCR技术从苦瓜基因组中扩增出MAP30基因片段，将其TA克隆和双酶切鉴定，再进行测序分析，并构建重组表达载体pET28aMAP30，转化到表达菌BL21(DE3)中，经IPTG诱导，用 NTANi2+ 树脂分离纯化所表达的 MAP30 融合蛋白，并经 SDSPAGE 电泳鉴定;纯化的蛋白作用于 BGC823 细胞后通过光镜和电镜进行形态学观察。 结果: 成功扩增出MAP30基因为861 bp， 与基因库中公布的DQ643967同源性为100%，与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建 pET28aMAP30原核表达重组质粒;通过NTANi2+树脂分离纯化目的蛋白，获得原核表达的大小约为30 000的MAP30融合蛋白，与预测一致;蛋白作用细胞后，细胞形态有明显变化。结论: 成功构建pET28aMAP30表达载体并获得原核表达的MAP30融合蛋白;重组MAP30蛋白能引起BGC823细胞明显的形态学变化。

【关键词】 苦瓜; MAP30; 克隆; BGC823细胞; 凋亡; 电镜

　　[Abstract] Objective: To clone the MAP30 gene and to express it in E.coli BL21(DE3) and to detect the influence of the MAP30 protein on proliferation in BGC823 cells. Methods:Polymerase chain reaction(PCR) was used to amplify the MAP30 gene from bitter guard genome DNA. Then the target gene was inserted into the vector pGEMT. The pGEMTMAP30 vector was transformed into E.coli DH5α and identified by restriction digestion and DNA sequencing. Then the MAP30 gene fragment was inserted directionally into expression vector pET28a.The pET28aMAP30 expression vector was transformed into E.coli BL21. The hisMAP30 fusion protein was expressed in E.coli BL21 induced by Isopropyl βD1thiogalactoside(IPTG). The target fusion protein was purified by Nicolumn and identified by SDSPAGE. The morphological change of cell was observed by light microscope and the electron microscope. Results: DNA sequence analysis showed the sequence of MAP30 was 861 bp. It had homology with DQ643967、DQ643968 and S79450.The prokaryotic expression vector pET28aMAP30 was efficiently transformed into E.coli BL21.The fusion protein was expressed at 30 ℃ after 0.5 mmol/L IPTG induction for 5 hours. The protein was conveniently purified using NTANiCharged Resin affinity column with above 90% purity and its relative molecular weight was 30 000. After BGC823 cells were treated by MAP30， the cells were observed obvious morphological changes. Conclusions:The prokaryotic expression vector pET28aMAP30 was constructed successfully and the fusion protein MAP30 was obtained from E.coli BL21.The recombinant MAP30 protein can cause the morphological change of BGC823 cells significantly.

　　[Key words] Momordica charantia(MC); MAP30; cloning; BGC823 cell; apoptosis; scanning electron microscope(SEM)

　　苦瓜属于葫芦科植物，主要分布于热带和亚热带地区，含有很多活性成分，其中包括一种核糖体失活蛋白MAP30。MAP30是含有263个氨基酸的单链蛋白，具有抗HIV、抗肿瘤[1]和抗菌活性[2]，经过限制性蛋白水解后的片段仍具有这些活性[3]，而且，重组蛋白具有与天然蛋白相同的功能和活性[2]。国外已经利用pRSET原核载体和ZYMVAGII病毒载体在相应的表达体系中对MAP30基因进行表达，获得的重组MAP30蛋白同样具有抗病毒、抗肿瘤和抗菌活性[2]。国内对于重组MAP30蛋白做了很多研究，甚至对不同苦瓜品种的MAP30基因进行克隆及序列分析[4]。最近研究表明，重组MAP30在体外还能抑制乙型肝炎病毒复制[5]。本文通过MAP30基因的克隆和生物信息学分析，构建原核表达载体，表达MAP30重组蛋白，并研究了重组MAP30蛋白对BGC823细胞形态的影响。

　　1 材料和方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌种及载体 克隆载体pGEMT购自Progema公司;原核表达载体pET28a及宿主菌E.coli DH5α和BL21(DE3) 菌株由江苏大学检验医学研究所保存;胃癌细胞BGC823由本实验室保存。

　　1.1.2 试剂和仪器 引物由上海生工生物工程有限公司合成;T4 DNA 连接酶 及DNA Gel纯化试剂盒均为 Promega 公司产品;限制性内切酶EcoR I和Xho I、DL2000 DNA标准参照物和Taq DNA 聚合酶及其配套缓冲液、dNTPs 均为 TaKaRa 公司产品;平衡酚购自天津生物工程公司;蛋白酶K、RNA酶、1kb DNA梯形标准参照物购自ToYoBo公司;NTANi2+蛋白纯化试剂盒购自Qiagen公司;RPMI1640购自GBICO公司;小牛血清为杭州四季青生物工程有限公司产品，PCR 基因扩增仪(Eppendor 公司)、自动凝胶成像系统(美国UVP公司)， CO2细胞培养箱(Thermo公司);倒置生物显微镜和数码成像分析系统(Nikon公司)，其他常规试剂按照《分子克隆实验指南》要求配制。

　　1.2 MAP30基因的扩增

　　取新鲜苦瓜叶子，用CTAB法提取苦瓜基因组DNA，然后设计引物，以提取的苦瓜基因组 DNA 为模板，按照普通 PCR 条件进行扩增，反应体积为 20 μl，反应条件:预变性 94 ℃ 5 min，变性 94 ℃ 40 s，退火 65 ℃ 40 s，延伸 72 ℃ 90 s，共进行 35 个循环，最后 1 个循环结束后于 72 ℃ 再延伸10 min，反应产物用 1% 琼脂糖凝胶电泳进行分析。

　　1.3 目的基因的TA克隆和鉴定

　　将胶回收纯化的PCR产物TA克隆进入载体pGEMT，4 ℃连接过夜，以连接产物(pGEMTMAP30)转化进入E.coli DH5α感受态，转化后的细菌涂布于含50 μg/ml 氨苄西林的 LB 平板上，37 ℃培养16 h。挑取菌落接种于含50 μg/ml氨苄西林的LB液体37 ℃ 250 r/min过夜培养，提质粒，用EcoR I和Xho I双酶切鉴定，筛选得到的阳性克隆送上海生工生物工程公司测序。

　　1.4 重组表达质粒的构建和鉴定

　　将重组pGEMTMAP30质粒用EcoR I 和Xho I双酶切，表达载体pET28a也进行双酶切，都进行胶回收，纯化的目的基因和表达载体按3∶1(摩尔数)用 T4 DNA 连接酶进行连接，反应体积为 10 μl，于 16 ℃连接过夜，将连接产物转化进入感受态BL21(DE3)中，涂于含卡那霉素(100 μg/ml)的 LB 固体培养基的平皿中，37 ℃生长 12～16 h。挑取单个菌落，37 ℃以 250 r/min 摇过夜菌，碱裂解法提取质粒， 进行PCR鉴定。

　　1.5 融合蛋白表达条件的优化

　　取经酶切鉴定构建成功的重组工程菌及对照菌BL21(DE3)转化菌，37 ℃培养过夜，按1∶50的比例接种于含卡那霉素(100 μg/ml)的LB液体培养基中，在37 ℃振荡至D(600nm)达到0.6(约2 h)，以不同浓度的IPTG诱导不同时间:① 加IPTG至终浓度分别为0、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0 mmol/L，30 ℃ 200 r/min继续振荡培养5 h;② 加IPTG至终浓度为0.5 mmol/L，分别诱导0、1、2、3、4及5 h。

　　收集菌液进行全菌蛋白的SDSPAGE电泳，取1 ml菌液，4000×g离心1 min，弃上清，在沉淀中加入100 μl PBS和100 μl 2×SDSPAGE样品缓冲液，混匀后，100 ℃水浴5 min，上样前10 000×g离心5 min，取上清加样。通过诱导前后全菌蛋白染色条带与阴性对照的对比，检出相应分子质量的外源蛋白MAP30的表达条带并确定最佳诱导条件。

　　1.6 重组蛋白的纯化

　　将已检测证实有MAP30蛋白表达的菌液300 ml，8 000×g，4 ℃离心10 min，弃上清后，按(菌重g/缓冲液体积ml)1∶5比例向菌液中加入结合缓冲液(pH8.0)，重悬细菌，混匀后冰浴，冰浴过程中超声裂解细菌(加入蛋白酶抑制剂1 mmol/L PMSF)。4 ℃，10 000×g离心20 min，弃沉淀，上清(主要以可溶性蛋白形式存在)移入塑料离心管中，加入0.5 ml 的 NTANi2+柱，不间断轻轻转动，室温2 h。然后过柱，加入洗涤液洗涤4～5次。当流出洗涤液检测D(280nm)&<0.01时，向 NTANi2+柱中加入1 ml 洗脱液(pH8.0)洗脱，收集洗脱液。SDSPAGE 检测纯化后蛋白的纯度，用0.22 μm 滤膜除菌，鉴定后于-20 ℃贮存。

　　1.7 细胞培养和形态学变化的观察

　　人胃癌细胞株BGC823采用10%小牛血清的RPMI1640 在37 ℃、含体积分数为5%的CO2培养箱中培养。取对数期的细胞，用3×105/ml的细胞浓度接种于25 ml的细胞培养瓶中，24 h后，加入已经过滤除菌的MAP30蛋白使其终浓度为30 μg/ml，培养24、48和72 h后在倒置光学显微镜下拍照，同时进行HE染色并拍照;收集蛋白处理72 h后的细胞，用戊二醛固定进行电镜扫描。

　　2 结 果

　　2.1 MAP30基因的TA克隆及序列比对

　　以苦瓜总DNA为模板进行PCR扩增，结果得到与预期相符的800 bp左右的特异性PCR带(图1);TA克隆后，经EcoR I和Xho I双酶切鉴定，得到的酶切片段与PCR产物的大小相同(图2)，表明目的片段已经克隆到pGEMT载体上;而且测序结果发现与基因库中公布的DQ643967同源性为100%，与DQ643968和S79450的同源性为99%。

　　2.2 原核表达载体的构建

　　质粒pET28a和TA克隆鉴定阳性的质粒双酶切后胶回收，连接后转化进入感受态BL21(DE3)中，随机挑取菌落，抽提质粒，进行PCR鉴定，发现其条带与以苦瓜DNA为模板的PCR产物大小一致(图3)，表明表达载体pET28aMAP30已经构建成功。

　　M1:DL2000 标准参照物;1:基因组PCR产物;2:pGEMTMAP30载体EcoR I+Xho I双酶切结果;3:pGEMTMAP30载体EcoR I单酶切结果;M2:1 kb DNA标准参照物

　　2.3 重组MAP30蛋白的表达与纯化

　　由图4和5可知，原核表达的MAP30融合蛋白经SDSPAGE鉴定大小约为30 000，与预测一致。MAP30蛋白产生的最佳诱导浓度为0.5 mmol/L IPTG，诱导时间为4～5 h;表达的蛋白与NTANi2+柱结合，经洗涤、洗脱，获得最终纯化的MAP30蛋白。

　　M:低相对分子质量标准蛋白;1:空菌全菌蛋白;2:空质粒转化子全菌蛋白;3～9:重组表达菌分别被0 、0.3、0.5、0.8、1.0、1.5和2.0 mmol/L IPTG诱导5 h的全菌蛋白　M:低相对分子质量标准蛋白;1:空菌全菌蛋白;2:空质粒转化子全菌蛋白;3～8:重组表达菌分别被0.5mmol/L IPTG诱导0、1、2、3、4和5 h的全菌蛋白

　　2.4 形态学观察

　　倒置显微镜下，未经处理的BGC823细胞形态均一，呈椭圆形，成簇生长;随着MAP30蛋白处理时间增加，细胞皱缩，形态不规则，多数细胞未见成簇生长，出现脱落。HE染色后，正常细胞的细胞核被染成深蓝色，胞质是红色，而蛋白处理后的细胞核与胞质都呈现红色(图6)，这表明细胞核出现了变化。

　　a:未处理组(×100);b～d:MAP30分别与细胞共培养24、48和72 h(×100);e:未处理组(HE染色×100);f:MAP30与细胞共培养48h(HE染色×100)

　　2.5 电镜观察

　　电镜下，MAP30(终浓度30 μg/ml)处理后的细胞与未处理过的细胞相比有很大变化。首先，处理后的细胞其表面微绒毛消失，与周围细胞脱接触;细胞缩小，细胞核浓缩，染色质凝集，核膜褶皱;细胞质浓缩，细胞器变化不大，细胞仍然保持细胞膜的完整性，没有出现内容物泄漏(图7)。

　　3 讨 论

　　核糖体失活蛋白是从植物或者微生物中提取的一种通过使核糖体失活而抑制蛋白质合成的蛋白毒素，具有N糖苷酶活性[6]。该蛋白有三种类型，I型RIPs由单个毒素亚基(A链)组成，而II型RIPs由一个毒素A链和一个像亚基的凝集素(B链)通过二硫键连接而成[7]，III型RIPs由一个N端RNA糖苷酶区域和一个延长的C端区域组成[8]。A链具有核糖体失活蛋白活性，B链含有一个凝集素区域，能与细胞表面的半乳糖苷反应从而促进A链进入细胞内，进而促使细胞凋亡[9]。MAP30是从苦瓜中分离出的一种I型核糖体失活蛋白，不仅具有RNA N糖苷酶活性[10]，而且能作用于DNA和 RNA，使环状DNA变为拓扑学失活状态[11]，以及抑制 HIV1整合酶的活性[12]。此外，MAP30不但具有多种生物活性，而且还具有良好的特异性，只对病毒感染的细胞或肿瘤细胞有效，而对未感染的人正常细胞，如 T细胞、 二倍体细胞和精细胞等均无细胞毒性[13-14]，这对抗肿瘤药物的研究具有重要意义。

　　本文用PCR的方法成功扩增出MAP30基因，因MAP30基因序列中不含有内含子，所以用苦瓜基因组DNA为模板进行扩增;并对DNA序列进行测定，测序结果发现与基因库中公布的DQ643967同源性为100%，与DQ643968和S79450的同源性为99%;成功构建了pET28aMAP30表达载体，而且诱导后蛋白表达的条带与对照组相比明显变粗，这表明重组MAP30蛋白已经表达，通过条件优化得到MAP30蛋白表达的最佳条件为0.5 mmol/L IPTG，30 ℃诱导4～5 h，经过超声破碎，Ni2+柱纯化，最后得到重组MAP30蛋白的纯度达90%以上;纯化的蛋白作用BGC823细胞后，细胞出现了明显变化，随着蛋白作用时间的增加，细胞逐渐变圆，游离于细胞液中不再贴壁，所以重组蛋白MAP30能诱导细胞发生明显的形态学变化。

　　苦瓜中天然的MAP30蛋白含量很低，而本文中MAP30基因工程菌的成功构建有利于MAP30蛋白的大量表达和纯化，而且重组蛋白具有与天然蛋白相同的功能和活性[8]，可为MAP30蛋白工业化的生产提供保障。我们只是从形态学上来确定该蛋白对BGC823细胞的影响，还需做进一步的机制研究，提供一个治疗肿瘤的靶点，让蛋白只对肿瘤细胞进行靶向攻击，同时还需要进行体内动物实验，研究MAP30蛋白的毒副作用，确定用药剂量，以便将其开发成新型抗肿瘤、 抗病毒药物制剂。

参考文献

　[1] LeeHuang S， Huang PL， Chen HC， et al. AntiHIV and antitumor activities of recombinant MAP30 from bitter melon[J]. Gene， 1995， 161(2):151-156.

　　[2] Arazi T， Lee Huang P， Huang PL， et al. Production of antiviral and antitumor proteins MAP30 and GAP31 in cucurbits using the plant virus vector ZYMVAGII[J]. Biochem Biophys Res Commun， 2002， 292(2):441-448.

　　[3] Huang PL， Sun Y， Chen HC， et al. Proteolytic fragments of antiHIV and antitumor proteins MAP30 and GAP31 are biologically active[J]. Biochem Biophys Res Commun， 1999， 262(3): 615-623.

　　[4] 杨洲平，黄乾明，刘一江，等. 不同苦瓜品种 MAP30 基因的克隆及序列分析[J]. 四川农业大学学报， 2007， 25(1): 58-62.

　　[5] Fan JM， Zhang Q， Xu J， et al. Inhibition on Hepatitis B virus in vitro of recombinant MAP30 from bitter melon[J]. Mol Biol Rep， 2009， 36(2): 381-388.

　　[6] Barbieri L， Battelli MG， Stirpe F. Ribosomeinactivating proteins from plants[J]. Biochim Biophys Acta， 1993， 1154(3/4): 237-282.

　　[7] Narayanan S， Surendranath K， Bora N，et al. Ribosome inactivating proteins and apoptosis[J]. FEBS Lett， 2005， 579(6): 1324-1331.

　　[8] Corrado G， Scarpetta M， Alioto D， et al. Inducible antiviral activity and rapid production of the ribosomeinactivating protein I from Phytolacca heterotepala in tobacco[J]. Plant Science， 2008， 174(4): 467-474.

　　[9] Hou X， Meehan EJ， Xie J， et al. Atomic resolution structure of cucurmosin， a novel type ribosomeinactivating protein from the sarcocarp of Cucurbita moschata[J]. J Struct Biol， 2008， 164(1): 81-87.

　　[10] Barbieri L， Gorini P， Valbonesi P， et al. Unexpected activity of saporins[J]. Nature， 1994， 372(6507):624.

　　[11] LeeHuang S， Huang PL， Nara PL， et al. MAP30: a new inhibitor of HIV1 infection and replication[J]. FEBS Lett， 1990， 272(1/2): 12-18.

　　[12] LeeHuang S， Huang PL， Huang PL， et al. Inhibition of the integrase of human immunodeficiency virus(HIV) type 1 by antiHIV plant proteins MAP30 and GAP31[J].Proc Natl Acad Sci， 1995， 92(19): 8818-8822.

　　[13] Schreiber CA， Wan L， Sun Y， et al. The antiviral agents， MAP30 and GAP31， are not toxic to human spermatozoa and maybe useful in preventing the sexual transmission of human immunodeficiency virus type 1[J]. Fertil Steril， 1999， 72(4): 686-690.

　　[14] Sun Y， Huang PL， Li JJ， et al. AntiHIV agent MAP30 modulates the expression profile of viral and cellular genes for proliferation and apoptosis in AIDSrelated lymphoma cells infected with Kaposi’s sarcomaassociated virus[J]. Biochem Biophy Res Commun， 2001， 287(4): 983-994.