氯膦酸二钠脂质体对重症急性胰腺炎大鼠胰腺损伤的影响

　　　　 作者：张勇 党胜春， 沙鑫， 蔡华忠， 陈敏， 姜德立， 张建新

【摘要】 目的： 探讨氯膦酸二钠脂质体(liposomal clodronate)对重症急性胰腺炎(SAP)大鼠胰腺损伤的保护作用。方法： 利用薄膜法制备氯膦酸二钠脂质体。采用胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠制作SAP模型。SD大鼠48只，随机分为对照组(C组)、空白脂质体组(P组)、氯膦酸二钠脂质体组(T组)。P组和T组大鼠制作SAP模型。制模2 h和6 h后取肠系膜上静脉血液，检测各组大鼠血清中淀粉酶、白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)的含量，观察各组胰腺组织的病理学变化及胰腺病理评分，免疫组化检测胰腺Caspase3的表达。结果： P组大鼠的血清淀粉酚水平较C组明显升高(P&<0.01)，T组大鼠的血清淀粉酶水平显著低于P组。P组较C组2、6 h血清IL6、TNFα明显升高(P&<0.01)，T组较P组大鼠的2、6 h血清IL6、TNFα水平显著降低(P&<0.01)。T组大鼠的胰腺病理变化较P组明显减轻，胰腺组织病理学评分明显降低 (P&<0.01)。胰腺Caspase3阳性表达增多。 结论： 氯膦酸二钠脂质体可选择性清除单核/巨噬细胞，对SAP大鼠胰腺损伤有保护作用。

【关键词】 重症急性胰腺炎;氯膦酸二钠脂质体;巨噬细胞

　　[Abstract] Objective: To investigate the protective effect of lipsomal clodronate against pancreas injury in rats with severe acute pancreatitis(SAP).Methods： Lipsomal clodronate was prepared by means of thin film. The models of SAP were established by injection of sodium taurocholate into the pancreatic capsule. The SAP models were prepared and randomly assigned to the model control group(C)，SAP+Liposome group(P)， SAP+Liposomal Clodronate group(T). The serum levels of IL6，TNFα were measured，and the changes of amylase(AMS) in serum were determined. Caspase3 expression was observed using immunohistochemitry. Pathologic alteration of pancrease were observed and the pathological score of pancreatic tissue was also estimated. Results： In P group，serum levels of AMS were significantly elevated compared with C group (P&<0.01). In T group， serum levels of AMS were significantly decreased as compared with P group (P&<0. 01). In P group，serum levels of IL6、TNFα were significantly elevated as compared with C group (P&<0.01). In T group， serum levels of IL6、TNFα were significantly decreased as compared with P group (P&<0.01). In T group，pathologic damages of pancreas were significantly decreased as compared with P group and pancreatic tissue pathological score were lower than those in P group(P&<0.01). In T group，expression of the Caspase3 were significantly elevated as compared with P group. Conclusion： Monocytes/macrophages can be depleted via phagocytosis of liposome encapsulated clodronate. Liposomal Clodronate could alleviate the pancreas injury in SAP rats.

　　[Key words] severe acute pancreatitis; liposomal clodronate; macrophages

　　重症急性胰腺炎(severe acute pancreatitis， SAP)严重危及人类生命， 是当前临床治疗的难症之一， 其病死率高达30%[1]。近年来细胞因子在SAP发病机制中的作用受到广泛关注和重视， 粒细胞过度激活， 体内促炎/抗炎自稳机制的持续性失衡是导致SAP发展的中心环节[2]。 全身促炎细胞因子的过度释放是SAP局部和全身病情恶化的主导因素[3-4]。目前大多认为由于胰腺腺泡细胞受损后巨噬细胞、淋巴细胞、中性粒细胞等活化，可释放出大量化学和炎性细胞因子，如白介素6(IL6)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白介素12(IL12)、白介素1β(IL1β)等，加重胰腺体本身损伤，并可致全身性脏器的损伤。其中巨噬细胞的浸润与激活是SAP发展的最初事件的启动因子之一[5]。针对巨噬细胞的细胞水平的治疗， 调整巨噬细胞的功能成为SAP治疗的研究方向。氯膦酸二钠(clodronate)是一种人工合成的双膦酸酯，多用于治疗骨质疏松等引起的骨质改变，其机制之一是形成具有毒性作用的ATP类似物，从而导致细胞内能量代谢障碍，引起破骨细胞凋亡，进而减轻破骨细胞对骨质的吸收[6]。van Rooijen[7]将氯膦酸二钠用脂质体包裹后注入体内可被巨噬细胞吞噬、消化，进而氯膦酸二钠释放、聚集于细胞内，达到一定浓度后，可导致巨噬细胞凋亡，但对无吞噬功能的平滑肌细胞、内皮细胞增殖无明显影响，证明氯膦酸二钠脂质体能选择性清除全身单核巨噬细胞。本研究利用脂质体介导氯膦酸二钠进入SAP大鼠体内巨噬细胞中，从干预巨噬细胞凋亡入手，观察其对SAP炎症及调控胰腺细胞凋亡Caspase3蛋白表达的影响，探讨其对SAP大鼠胰腺损伤的保护作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　SD大鼠48只(体质量 350 ～400 g)由江苏大学动物中心提供;氯膦酸二钠(上海伟进生物科技有限公司);牛磺胆酸钠(美国Sigma公司);IL6，TNFα ELISA试剂盒(美国Invitrogen公司)，Caspase3试剂盒(美国R&&D公司)。

　　1.2 氯膦酸二钠脂质体的制备

　　参照文献[8]制备大直径多层脂质体的方法加以改进:先准备膦脂酰胆碱(phosphatidylcholine)的氯仿溶液，浓度为 100 mg/ml，-20 ℃避光保存备用。使用500 ml 的梨形烧瓶，将 8 mg 胆固醇溶解在 10 ml 氯仿中。加入 0.86 ml储备的膦脂酰胆碱溶液(含有膦脂酰胆碱 86 mg)，37 ℃低真空，逐渐旋转蒸馏除去氯仿。最后在梨形瓶内壁形成稀薄均匀的乳白色膦脂膜。随后用0.6 mol/L(2.5 g氯膦酸二钠溶解在10 ml磷酸缓冲液中)的氯膦酸二钠磷酸缓冲盐(phosphate buffered sodium，PBS)溶液洗脱、扩散磷脂膜，形成乳白色悬液，而空白脂质体制备用无菌的 PBS洗脱。乳白色悬液在室温下通氮气保存2 h，在水浴声波震荡器中震荡 3 min后再在室温下保存2 h，使脂质体膨胀。使用无菌的PBS清洗脂质体2～3次，除去未被包裹的氯膦酸二钠。最后沉淀的脂质体大块在 4 ml 的 PBS中再次悬浮，形成乳白色的胶体溶液。获得的氯膦酸二钠脂质体悬液(4 ml)大约含有 20 mg 的氯膦酸二钠。应用紫外分光光度法测定脂质体中氯膦酸二钠的浓度及包封率，测定包封率约为6%。

　　1.3 动物分组及处理

　　大鼠48只，随机分为3组:对照组(C组)，空白脂质体组(P组)，氯膦酸二钠脂质体组(T组)。每组16只。各组又分为术后2，6 h组，每组8只。大鼠术前12 h禁食，自由饮水。肌肉注射氯胺酮进行麻醉 (2 mg/kg)。麻醉后开腹胰腺被膜下均匀注射5%牛磺胆酸钠(2 ml/kg体质量)制作SAP模型[9]。P组于造模后立即大鼠尾静脉注射空白脂质体(4 ml/kg体质量);T组于造模后尾静脉注射氯膦酸二钠脂质体(4 ml/kg体质量);C组予以开腹后胰腺包膜下均匀模拟胰腺被膜穿刺操作，整个注射过程缓慢，保持常温。

　　1.4 指标测定

　　(1)淀粉酶(AMS)、 IL6、TNFα测定:于制模后2，6 h肠系膜上静脉取血2 ml，3 000 r/min离心10 min，取上层血清-20 ℃保存。自动生化分析仪测定血清AMS含量。取上述血清，严格按照ELISA试剂盒说明测定2，6 h血清IL6、TNFα含量。(2)胰腺组织形态学观察:取胰腺头部标本2 cm左右，40 g/L甲醛溶液固定，修剪、脱脂、石蜡包埋和切片，苏木精伊红(HE)染色，光镜下观察6 h胰腺病理改变。按Schmidt评分标准[10]评分。(3)免疫组化检测胰腺Caspase3蛋白的表达:采用SP两步法染色， 操作过程按照试剂盒说明书进行， DAB显色， 苏木素复染， 封片。光镜下观察，含有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。

　　1.5 统计学处理

　　实验结果以±s表示，采用SPSS 11.5统计软件进行数据分析，采用单因素方差分析，方差不齐采用KruskalWallis检验，P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 氯膦酸二钠脂质体对SAP大鼠血清淀粉酶的影响

　　P组和T组血清淀粉酶含量在2 h和6 h显著高于C组(P&<0. 01)。T组血清淀粉酶含量较P组显著降低(P&<0. 01)， 见表1。表1 3组大鼠血清淀粉酶水平与C组比较，a:P&<0.01;与P组比较，b:P&<0.012.2 氯膦酸二钠脂质体对SAP大鼠血清IL6、TNFα的影响

　　SAP大鼠模型诱导成功后，P组各时间点血清IL6、TNFα浓度较C组明显升高(P&<0. 01)，T组血清IL6、TNFα浓度较P组明显下降(P&<0. 01)，见表2。表2 3组大鼠血清IL6、TNFα水平±s，n=8与C组比较，a:P&<0.01;与P组比较，b:P&<0.012.3 胰腺的大体及微观病理变化

　　2.3.1 6 h胰腺病理形态改变 大体观察:C组胰腺未见明显改变;P组大鼠胰腺肿胀，质地较硬，有大片黄色坏死灶，网膜、肠系膜上见大量皂化斑，腹腔有中至大量血性腹腔积液;T组胰腺呈灰白色，腹腔少量淡红色腹腔积液渗出。6 h光镜下可见(图1):C组胰腺结构良好，可见完整的胰岛;P组可见腺叶间灶性水肿、无结构坏死区和组织间隙红细胞分布，并可见炎性细胞浸润，坏死腺泡细胞呈点状、片状分布;T组胰腺出血、坏死，炎性细胞浸润等较P组明显减轻。

　　2.3.2 各组胰腺病理评分 胰腺Schmidt评分C组胰腺病理正常，T组胰腺病理损害程度较P组明显减轻(P&<0.01)，见表3。表3 3组大鼠胰腺病理评分

　　2.4 胰腺Caspase3阳性表达

　　见图2。C组可见正常组织结构，P组较C组Caspase3阳性表达增多，组织结构紊乱，T组Caspase3较P组显著增多，尚可见部分正常组织结构。

　　3 讨 论

　　SAP是从腹腔(胰腺)病变进展而来的全身性炎症反应过程，巨噬细胞在炎症反应中发挥着重要作用，其产生的多种细胞因子和炎症介质是炎症反应发生、发展、协调与消散的内在机制。这种炎症过程造成的微环境变化，使得胰腺对损伤性刺激更为敏感。SAP早期炎症反应主要与胰腺实质、胰周浸润的巨噬细胞有关，最终将导致多器官功能衰竭[11]。SAP发病时，病变胰腺组织作为抗原或炎症刺激物激活巨噬细胞释放大量的炎症介质及细胞因子，如IL1β、IL6、IL8、TNFα等，产生级联瀑布效应，造成局部组织和全身性脏器的损伤。抑制巨噬细胞的活化能够增强对损伤因素的抵抗力，改善疾病本身的病理损害并在一定程度上改善预后。

　　自20世纪60年代开始，脂质体就作为药物载体开始应用，近年来随着生物技术的发展，脂质体作为药物载体的研究越来越受到人们的重视。由于脂质体具有类似细胞膜的结构，进入人体以后主要被内皮网状系统吞噬而激活机体的自身免疫功能，并改变被包封药物的体内分布，使药物主要在肝、脾、 胰、肺、骨骼等组织器官中蓄积。van Rooijen等[12]报道，静脉内注射氯膦酸二钠脂质体可以选择性地清除体内巨噬细胞，巨噬细胞通过吞噬作用摄取脂质体，其磷脂酶破坏脂质体的磷脂双分子层，药物在细胞内释放从而诱导了巨噬细胞的凋亡，游离的氯膦酸二钠本来是用于治疗骨质疏松等骨疾病的药物，没有明显的细胞毒性，而用于包埋的脂质体成分是卵磷脂和胆固醇，也没有毒性，即可成为临床治疗某些疾病的手段。目前，氯膦酸二钠脂质体被广泛应用于巨噬细胞功能的研究[13]。本课题研究小组亦证实应用氯膦酸二钠脂质体可以诱导SAP大鼠腹腔巨噬细胞的凋亡，为SAP的临床治疗提供了理论依据[14]。

　　Caspase是一组具有相似氨基酸顺序、二级结构的半胱氨酸蛋白酶， 主要诱导凋亡和参与炎症反应。活化的Caspase是细胞凋亡的关键酶类。目前研究最多且功能相对较明确的是Caspase3。Caspase3被称为凋亡的“执行者”，是细胞凋亡信号传导过程中的中心环节，检测活化的Capase3水平可反映细胞凋亡过程[15]。研究发现， 轻度急性胰腺炎胰腺腺泡细胞凋亡较多而坏死很少， 急性坏死性胰腺炎腺泡细胞出现大量坏死， 因而凋亡在急性胰腺炎发病中的意义与作用受到人们的重视。病理状态下腺泡细胞发生凋亡可以减少因坏死释放的活性胰酶， 减轻炎症介质的瀑布样级联释放， 这可能是急性胰腺炎时机体的自我保护机制之一[16]。有研究表明，抑制TNFα能够上调Caspase3蛋白表达， 诱导细胞凋亡， 降低胰腺炎病理学评分， 改善急性胰腺炎预后[17]。本研究表明，给予氯膦酸二钠脂质体能显著降低SAP大鼠血中IL6、TNFα的含量(P&<0.01)，AMS水平明显下降(P&<0.01)，胰腺病损程度减轻。同时氯膦酸二钠脂质体能诱导Caspase3蛋白的表达增多，说明其可能通过诱导巨噬细胞凋亡，显著减少SAP大鼠血中的炎症介质，如TNFα等，进而对SAP胰腺细胞凋亡也具有促进作用。本研究说明氯膦酸二钠脂质体可以通过诱导SAP大鼠巨噬细胞的凋亡，对SAP大鼠胰腺损伤具有一定的保护作用。通过干预巨噬细胞的凋亡，减少炎症因子的释放，从而减轻SAP大鼠的炎症反应，对进一步改善SAP大鼠的预后有一定的作用。本研究为临床SAP的治疗提供了一种新的思路。

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