Bim1基因在胃癌中的表达及其临床意义

　　　　 作者：祁卫东， 陈锁成， 王胜， 许文荣， 许晓蒙，孙靖

【摘要】 目的： 探讨Bim1基因在胃腺癌细胞株、胃癌组织和癌旁组织以及胃癌患者外周血中的表达水平及其与临床病理特征的关系。方法: 收集80例胃癌患者的癌组织和癌旁组织，培养胃腺癌细胞株(SGC7901，BGC823，AGS)，采用RTPCR和实时PCR的方法检测Bmi1基因的表达情况。另外同时收集Bim1基因阳性胃癌患者外周血标本以及健康体检者外周血标本各20例，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离获得单个核细胞，采用巢式PCR和实时PCR的方法检测其Bmi1基因的表达情况。采用蛋白质印迹法验证胃癌组织和对应的癌旁组织以及胃癌患者及健康体检者血单个核细胞中Bim1蛋白的表达情况。 结果: 胃腺癌细胞株(SGC7901，BGC823，AGS)中Bim1均高表达;胃癌组织中Bim1表达(85%)明显高于癌旁组织(30%)(P&<0.05);胃癌患者外周血单个核细胞Bim1基因的阳性率为60%，显著高于健康体检者(P&<0.05)。胃癌组织和癌旁组织中Bim1的蛋白水平存在差异，而在外周血中未见明显差异。结论: Bim1基因在胃腺癌细胞株以及胃癌组织中高表达，胃癌患者外周血单个核细胞Bim1的阳性率高于健康体检者，通过检测Bim1基因可为胃癌的临床诊断及其靶向治疗提供新途径。

【关键词】 Bim1基因; 胃癌; RTPCR; 实时PCR

　　[Abstract] Objective: To detect the expression of Bim1 gene in gastric carcinoma， adjacent noncancerous tissues and the peripheral blood of the corresponding gastric carcinoma patient，to explore whether its expression is correlated with the clinical pathology of the gastric carcinoma. Methods: The expression of Bim1 gene was detected by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR) and realtime PCR in gastric carcinoma，and adjacent noncancerous tissues from 80 patients and the gastric carcinoma cell strain(SGC7901，BGC823，AGS). Furthermore， we detected at the same time the expression of Bim1 gene in the peripheral blood of both 20 corresponding gastric carcinoma patients and health people.Using realtime PCR and nested RTPCR detected the expression of Bim1 gene in the peripheral blood. Western blot were employed to detect Bim1 protein level. Results: The positive rates of Bim1 expression was found in gastric tumor tissues was 85% (68/80)， which was significantly higher than those was found in the matching， adjacent noncancerous tissues 30% (24/80) (P&<0.05)， A high level of Bim1 expression was found in the gastric carcinoma cell strain(SGC7901，BGC823，AGS). In addition， The positive rates of Bim1 expression in gastric carcinoma patient was higher than the healthy people. Bim1 expression at the transitional levels were markedly different between gastric carcinoma and adjacent noncancerous tissues by Western blot analysis. Conclusion: Bim1 expression may play an important role in the development of the gastric cancer. It may be a novel diagnostic marker of human gastric cance.

　　[Key words] Bim1 gene; gastric cancer; RTPCR; realtime PCR

　　Bim1基因是多梳基因(polycomb group genes，PcG)家族成员中的转录抑制因子，是PRCl complex或E2F6 complex的组成成员之一，为一种广泛表达的核蛋白，调节HOX基因转录[1]。1991年荷兰癌症中心在癌细胞中首次发现该基因，作为一种原癌基因与另一种癌基因cmyc共同导致B细胞非霍奇金淋巴瘤的发病[2]。人类Bim1基因克隆和定位在10号染色体短臂13区，含有10个外显子和10个内含子。Reinisch等[3]研究发现，Bim1在胃肠道干细胞、特殊分化细胞及肿瘤细胞中的蛋白表达水平增高，Bim1 的高表达见于人类淋巴瘤[4-6]的发生过程中[7-12]。近年来的研究证实了实体瘤，包括肺癌、结直肠癌、乳腺癌，鼻咽癌、口腔癌、皮肤癌及胃癌的肿瘤细胞均有Bim1基因的高表达。本研究检测了胃癌患者癌组织及外周血中Bim1的表达，并分析其与临床病理因素的相关性，探讨其在胃癌诊断中的意义。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源

　　80例配对的胃癌患者癌组织和癌旁组织(距癌变部位边界5 cm以外且经病理证实无癌变的组织)，取自2008年7月至2009年10月江苏大学附属人民医院普外科收治并经病理组织学确诊的胃癌患者，术前均未接受化疗及放疗。其中男46例，女34例，年龄41～78岁，中位年龄58岁。癌组织和癌旁组织标本各取约100 mg左右，-70 ℃冻存。另外收集20例癌组织经RTPCR检测Bim1呈阳性的胃癌患者外周血标本，同时收集20例健康体检者外周血标本，用淋巴细胞分离液(Ficoll)分离(1 100×g，30 min)获得单个核细胞。

　　1.2 仪器和试剂

　　胃癌细胞株:SGC7901、BGC823、AGS(江苏大学检验医学研究所提供)，Ficoll分离液，RNA提取试剂 Trizol(Invitrogen 公司)、逆转录试剂盒(ToYoBo公司)。PCR产物纯化试剂盒(Axygen，USA)，TA克隆试剂盒(Promega，USA)，质粒小提试剂盒(Axygen，USA)，荧光定量PCR分析仪(Corbett Research)，普通PCR仪(Thermo Hybaid公司)，梯度PCR仪(Eppendorf公司，德国)，凝胶成像分析系统。

　　1.3 细胞培养

　　将胃腺癌细胞株(SGC7901、BGC823、AGS)置于含10%小牛血清的DMEM基础培养基，37 ℃在5%的CO2培养箱中培养，每3天换液1次，每6～7天传代1次，显微镜下观察细胞生长状况。收集1 ml悬浮细胞离心5 min(800×g)，用PBS冲洗3次。加入1 ml Trizol，吹打混匀，室温消化15 min，装入1.5 ml 的不含RNA酶Eppendorff管中，-70 ℃保存备用。

　　1.4 组织单个细胞制备

　　将100 mg胃癌及癌旁组织置于无RNA酶的组织研磨器中的铜网上，加入1 ml含0.1% DEPC 的PBS，使用一次性塑料研棒将组织研磨成单个细胞，转入1.5 ml 的不含RNA酶的Eppendorff管中，1 000×g离心5 min，弃上清，用1 ml含0.1% DEPC 的PBS洗两遍，离心，加入1 ml Trizol，吹打混匀，室温消化20 min，装入1.5 ml 的不含RNA酶的Eppendorff管中，用作RNA提取;-70 ℃保存备用。

　　1.5 总RNA提取

　　用Trizol试剂提取胃癌及癌旁组织的总RNA，每份加入200μl 冰冷的氯仿，反应10 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，吸取上清液至另一1.5 ml 不含RNA酶的Eppendorff管中，加入600 μl 冰冷的异丙醇，室温反应10 min，4 ℃ 12 000×g离心10 min，弃上清，加入0.1% DEPC水处理过的75%乙醇洗涤，4 ℃12 000×g离心5 min，重复1次，弃上清，将沉淀置无菌超净台中干燥约30 min至半透明，加入30μl DEPC处理过的双蒸水，混匀，4 ℃静置30 min，使用核酸蛋白检测仪检测样品浓度。采用逆转录试剂盒以Oligo(dT)为引物合成cDNA第一链，-20 ℃保存。

　　1.6 引物设计

　　引物参照基因库中提供的Bim1 mRNA的完整序列跨外显子设计 Bim1 mRNA序列和内参基因GAPDH mRNA序列。Bim1基因 RTPCR和实时PCR使用Bim1内侧引物，巢式RTPCR使用Bim1内外侧引物。引物由上海生物工程技术有限公司合成，引物资料见表1。

　　1.7 RTPCR

　　以1.0 μg总RNA为模板，以Oligo(dT)为引物，合成cDNA。以cDNA为模板，进行PCR扩增，引物采用表1中Bim1内侧引物，退火温度59 ℃。反应体系：10×缓冲液(Mg2+浓度为25 mmol/L) 2.5 μl、10 mmol/L dNTP 0.5 μl、10 pmol/μl的上下游引物各0.5 μl，5 U/μl Taq酶0.2 μl，cDNA模板 1μl，加ddh3O至25 μl，扩增条件:94 ℃ 5 min，94 ℃变性30 s，退火温度59 ℃ 30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环;72 ℃ 10 min。 取5 μl扩增产物于2%琼脂糖凝胶中电泳， 凝胶成像仪紫外透射观察结果。表1 Bim1及内参基因引物

　　1.8 实时PCR标准曲线制备及Bim1 mRNA相对定量 采用普通PCR扩增Bim cDNA和β肌动蛋白 cDNA，采用Bim1的内侧引物，扩增体系:10×缓冲液2.5 μl、25 mmol/L 的Mg2+2.5 μl、25 mmol/L的dNTPs 2.5 μl、10 μmol/L的上下游引物各0.5 μl、5 U/μl 的rTaq酶0.2 μl、模板1 μl，加双蒸水定容至25 μl。反应条件:94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35个循环;72 ℃ 5 min;4 ℃保存。纯化PCR产物，将PCR产物连接到T载体上，转化DH5α感受态大肠埃希菌，制备102-109拷贝数/μl浓度的Bim1基因和β肌动蛋白标准品。在普通PCR体系中加入100×纯化BSA 1 μl、1∶4 000稀释的SYBGreen Ⅰ 1 μl以及cDNA或质粒模板2 μl，加水至25 μl，按照普通PCR扩增条件在实时PCR仪上扩增。实时PCR 分析仪为Rotorgene 6000 RealTime cycler (澳大利亚Corbett Research公司)。扩增结束后，取5 μl 实时PCR产物，用琼脂糖电泳定性检测PCR产物。Bim1 mRNA表达水平=Bim1拷贝数/β肌动蛋白 cDNA拷贝数。

　　1.9 巢式RTPCR检测Bim1基因mRNA水平表达

　　10×缓冲液2.5 μl(Mg2+浓度为25 mmol/L)， 2.5 mmol/L dNTPs 2.5 μl，10 μmol/L的上下游引物(Bim1外侧引物和β肌动蛋白) 各0.5 μl，5 U/μl rTaq酶0.2 μl，模板2 μl，加水至25 μl，扩增条件:94 ℃预变性5 min;94 ℃变性34 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，25个循环;72 ℃ 5 min;4 ℃终止反应。取第一轮产物1 μl，1∶100稀释，取出1 μl作为第二轮PCR反应的模板，引物为Bim1内侧引物。其他试剂上样量与第一轮相同，加水至25 μl，扩增条件:97 ℃预变性5 min;97 ℃变性5 s，56 ℃～59 ℃退火35 s，72 ℃延伸35 s，25个循环;4 ℃终止反应。

　　1.10 蛋白质印迹法检测Bim1水平

　　每50 mg胃癌组织和配对癌旁组织以及胃癌患者和健康体检者单个核细胞标本提取总蛋白并测定蛋白质浓度。蛋白电泳分离后转膜，封闭。羊抗人Bim1抗体1∶100稀释，以鼠抗人GAPDH抗体(1∶5 000)为内参照。二抗为辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG抗体(GAPDH)或兔抗羊IgG抗体(Bim1)，按1∶5 000稀释。按ECL化学发光试剂盒操作说明曝光，并使用Typhoon9400荧光差异蛋白表达检测分析系统扫描并保存图像。

　　1.11 统计学处理

　　Bim1在胃癌组织和癌旁组织之间的表达差异以及在胃癌患者及健康体检者血单个核细胞中的表达与患者预后分析均用χ2检验进行统计分析;采用SPSS13.0软件，P&<0.05(双侧)为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 Bim1基因在癌细胞系中的表达

　　用RTPCR扩增3株胃腺癌细胞株中Bim1 mRNA的表达，结果显示，胃癌细胞系SGC7901，BGC823及AGS中Bim1的mRNA均高表达。见图1。

　　2.2 GAPDH与Bim1标准质粒构建及实时PCR

　　制备了Bim1基因和GAPDH基因标准品，Bim1基因在0.5×103/μl～0.5×109/μl范围内扩增线性系数为0.999 52，扩增效率为1.077，GAPDH基因在103/μl～108/μl 范围内扩增线性系数为0.999 83，扩增率为1.18，可以用于实时定量PCR。见图2。

　　2.3 RTPCR及实时PCR检测Bim1基因在配对胃癌组织和癌旁组织中的表达 RTPCR结果显示，80例胃癌患者癌组织中Bim1 mRNA的阳性率为85.0%(68/80)，癌旁组织中阳性率为30%(24/80)，差异有统计学意义(χ2=69.39， P&<0.01)。其中，11%(9/80)的胃癌患者癌组织和癌旁组织均不表达Bim1 mRNA，8.7%(7/80)的胃癌患者癌旁组织表达Bim1 mRNA，但癌组织不表达。另外，从经RTPCR检测Bim1阳性的胃癌患者中随机选取10例胃癌患者癌组织周围淋巴结组织，检测Bim1的表达，有7例Bim1的表达呈弱阳性。见图3。实时PCR结果显示，胃癌组织中Bim1 mRNA表达显著高于其癌旁组织和胃癌周围转移淋巴结组织，胃癌周围转移淋巴结组织

　　M:标准参照物DL2000;C1、D1:胃癌周围转移淋巴结组织Bim1弱表达;T:胃癌组织，其中 T2T8 Bim1基因均高表达;N:癌旁组织，其中N2N8中，除了N4、N8表达Bim1，其余均不表达

　　2.4 RTPCR及实时PCR检测胃癌患者及健康体检者血单个核细胞中Bim1基因的表达

　　收集经RTPCR检测癌标本Bim1为阳性的胃癌患者外周血标本及健康体检者血单个核细胞标本各20例，采用巢式PCR检测Bim1 mRNA的表达，结果显示，60%(12/20)的胃癌患者在手术前血单个核细胞Bim1表达阳性，15%(3/20)的健康体检者单个核细胞中Bim1表达阳性，其余均为阴性(图5)。实时PCR结果显示，胃癌患者单个核细胞中Bim1的表达高于健康体检者，P&<0.05(图6为检测的三对胃癌患者及健康体检者的血单个核细胞Bim1基因结果)。

　　a1a2: 健康体检者单个核细胞Bim1的表达，其中a1阳性，a2不表达;b1b4: 胃癌患者单个核细胞Bim1的表达，其中b1b3阳性，b4不表达;B:空白;M:标准参照物DL2000

　　2.5 Bim1蛋白的表达

　　以GAPDH的蛋白表达为内参照， Bim1蛋白在胃癌患者癌组织中强表达，而在癌旁组织中呈弱表达，两者表达水平有差异。而在胃癌患者和健康体检者的外周血单个核细胞中Bim1均呈强表达，表达水平未见明显差异。见图7。

　　2.6 Bim1基因表达与患者预后分析

　　胃癌患者手术1周后外周血单个核细胞Bim1基因表达阳性的患者30个月内复发或转移率为100%(13/13)，复发后死亡率为46.2%(6/13)。而17例术后1周外周血单个核细胞Bim1基因表达阴性的胃癌患者30个月内复发或转移者只有1例(5%)。外周血单个核细胞Bim1基因表达与患者预后之间关系有统计学意义(P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　胃癌是我国胃肠道肿瘤高发和高致死率的恶性肿瘤之一，以外科手术切除为主配以放化疗治疗仍是重要的胃癌治疗手段，然而，早期胃癌由于缺乏相关症状，临床上难以做到早期诊断，许多患者发现时已是晚期，手术预后效果较差。研究表明基因表达异常与肿瘤的发生发展、转移及其预后具有很大的相关性。Bim1基因是一种原癌基因，表达于胚胎干细胞、造血干细胞、间质干细胞、较为幼稚的成体细胞以及包括淋巴瘤，白血病，骨髓增生异常综合征，乳腺癌，肺癌，结肠癌等多种肿瘤细胞[4，7，10，13]，Bim1对于维持干细胞的增殖能力起着至关重要的作用，敲除该基因会导致细胞增殖缓慢，凋亡加速。相反，转染外源Bim1会使细胞增殖加速。近年来，一些实验研究已经证实，Bim1直接参与细胞增生和恶性转化，导致肿瘤侵袭能力增强、淋巴结转移[14]。本研究发现，胃癌细胞株(AGS，BGC823，SGC7901)以及85%胃癌组织中Bim1基因均出现过高的表达，表达阳性的患者预后较差，这与文献报道相符[15]。

　　许多研究表明，肿瘤患者外周血中都存在微小转移病灶，甚至在手术后较长的一段时间也存在微小残留病灶，这会导致肿瘤的复发或者转移。我们研究了Bim1基因在胃癌中的微小残留病灶或转移病灶中是否表达，以及该基因是否可以作为肿瘤患者预后的参考指标。结果表明，采用普通的RTPCR无法检测Bim1基因在肿瘤患者外周血中的表达，而经巢式RTPCR检测Bim1阳性胃癌患者的血标本中，约60%(12/20)的胃癌患者在手术前外周血单个核细胞Bim1表达阳性，而15%(3/20)的健康体检者血单个核细胞中Bim1表达弱阳性。这个结果提示我们，在外周血中检测Bim1 mRNA是诊断胃肠道肿瘤的较可靠方法，然而，采用巢式RTPCR在患者外周血中进行单基因Bim1检测也存在漏检和特异性不高的问题。

　　本实验研究结果表明，Bim1基因的过度表达在消化道肿瘤的发生发展中可能起着关键的作用，并且，采用巢式RTPCR在患者组织和外周血中检测Bim1 mRNA有助于对患者的诊断和预后评估，国内外关于Bim1基因的表达与肿瘤预后的关系报道较少。本实验结果提示，Bim1基因在胃癌组织中的过表达，可能为早期胃癌诊断及判断预后的有效指标之一，可能成为胃癌治疗潜在的新靶点。

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