日本血吸虫HGPRT重组抗原与不同佐剂联合应用对小鼠免疫保护作用的研究

　　　　作者：胡媛， 沈玉娟， 曹建平， 徐馀信， 卢潍媛，周何军， 张 璟， 李小红， 权 红， 刘述先

【摘要】 目的： 观察日本血吸虫(大陆株)次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase， HGPRT)重组抗原(reSjc HGPRT)与ISA206或弗氏佐剂联合免疫对小鼠诱导抗日本血吸虫感染的保护作用。 方法： 雌性C57BL/6小鼠随机分为5组:reSjc HGPRT加ISA206佐剂免疫组、reSjc HGPRT加弗氏佐剂组、ISA206佐剂对照组、弗氏佐剂对照组和感染对照组。20 μg重组抗原和ISA206或弗氏佐剂乳化后小鼠项背部多点皮下注射，共免疫3次，每次间隔2周。佐剂对照组小鼠仅注射ISA206或弗氏佐剂和生理盐水，感染对照组不注射任何重组抗原或生理盐水。于末次免疫后3周，每只小鼠经腹部皮肤感染(30±1)条日本血吸虫尾蚴，6周后剖杀小鼠，门脉灌注收集成虫，计数成虫数、雌雄合抱数和小鼠肝组织虫卵数。在免疫前、攻击感染前和小鼠剖杀前分别采血并分离血清，用ELISA检测血清中特异性IgG抗体。 结果： 重组抗原加ISA206佐剂或弗氏佐剂免疫组均诱导小鼠产生特异性IgG抗体应答，与感染对照组和弗氏佐剂对照组相比，差异有统计学意义(P&<0.05);诱导小鼠产生的减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别为53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%，与感染对照组和2种佐剂对照组相比均有统计学意义(P&<0.05)。结论: reSjc HGPRT与ISA206或弗氏佐剂联合免疫，可诱导小鼠产生抗血吸虫感染保护作用。

【关键词】 日本血吸虫; 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶重组抗原; 佐剂; 免疫保护性

　　[Abstract] Objective: To investigate the protective immunity of recombinant hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase of Schistosoma japonicum(reSjc HGPRT)plus Montanide ISA 206 or Freund’s adjuvants in mice. Methods： Female C57BL/6 mice were randomly pided into five groups， reSjc HGPRT plus Montanide ISA 206 adjuvant， reSjc HGPRT plus Freund’s adjuvant， two adjuvant control groups and challenged control group. In Montanide ISA 206 adjuvant or two groups of reSjc HGPRT plus Freund’s adjuvant， each mouse was immunized subcutaneously with 20 μg reSjc HGPRT emulsified in Montanide ISA 206 or FCA/FIA， respectively， while in two adjuvant control group， each mouse was injected subcutaneously with sterile normal saline emulsified in FCA/FIA or Montanide ISA 206 respectively. For challenged control group， mice were not treated with recombinant antigen or adjuvant. All mice were vaccinated for three times in an interval of 2 weeks. Two weeks after final immunization， each mouse was challenged with(30±1) cercariae of S. japonicum. At the sixth week after challenged， all mice were sacrificed and the number of worms， pairs of worm and eggs in the livers were counted. The sera collected respectively from mice before immunized， challenged and killed were identified by ELISA assay to detect specific antiSjcHGPRT IgG antibody. Results: The levels of specific IgG antibody in two immunized groups with reSjc HGPRT was higher than that of challenged control group. Also，compared with the challenged control， the worm reduction rates， worm in pairs rates and egg reduction rates in mice immunized with reSjc HGPRT plus Montanide ISA 206 adjuvant and plus Freund’s adjuvant were 53.7%， 59.3%， 44.9% and 43.3%， 44.1%， 33.0%， respectively(P&<0.05). Conclusion: A better immune protection could be obtained in mice immunized with recombinant antigen plus plus Montanide ISA 206 or Freund’s adjuvants against S. japonicum.

　　[Key words] Schistosoma japonicum; reSjc HGPRT; adjuvant; immune protection

　　日本血吸虫病是严重危害人类健康的重要寄生虫病之一，目前尚无有效的预防措施。而抗血吸虫疫苗能够增强人群的抗血吸虫感染和再感染的能力，是长期综合防治血吸虫病的重要补充措施。日本血吸虫的生活史复杂，特别是由于其与宿主长期共进化，导致日本血吸虫能够逃避宿主的免疫攻击。故寻找合适的疫苗候选分子和选择适当的佐剂是疫苗研究的重点之一。

　　次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase， HGPRT)是一种与调控细胞核苷酸代谢有关的酶，在血吸虫体内有很高的活性，为血吸虫生长发育所必需。本研究在对日本血吸虫大陆株HGPRT编码基因克隆和表达取得成功的基础上[1]，分别采用弗氏佐剂、Montanide ISA 206佐剂与重组蛋白乳化后免疫C57BL/6小鼠，并攻击感染血吸虫，探讨该重组蛋白(reSjc HGPRT)与佐剂联合抗血吸虫感染的保护作用。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　实验用日本血吸虫大陆株感染的阳性钉螺由本所钉螺室提供，以常规方法逸得尾蚴。雌性6周龄的C57BL/6小鼠52只，由中国科学院上海实验动物中心提供。重组质粒pET28aSjc HGPRT的BL21 由本室构建。

　　1.2 重组抗原reSjc HGPRT的制备和纯化

　　挑取含重组质粒pET28aSjc HGPRT的BL21(DE3)细菌的单个菌落，接种于3 ml LB/Kan (30 μg/ml)培养液中，37 ℃ 250 r/min振荡培养12 h，1 ml过夜培养菌转种于100 ml LB/Kan (30 μg/ml)培养液中，37 ℃ 250 r/min振荡培养4 h，至D(600 nm)≈0.6时，加入异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L诱导细菌表达，25 ℃ 250 r/min诱导后4 h，收集培养液，5 000×g离心15 min，弃上清，重悬细菌沉淀于50 ml PBS中，冰浴高强度超声30 s，停30 s，超声3次，10 000×g离心15 min，离心后收集上清，用Qiagen公司的组氨酸亲和层析柱纯化蛋白。SDSPAGE电泳分析目的蛋白，紫外分光光度仪测定蛋白质浓度[D(260 nm)和D(280 nm)]。

　　1.3 动物免疫

　　将52只雌性C57BL/6小鼠随机分为5组，第Ⅰ组为感染对照组，第Ⅱ组和第Ⅲ组分别为弗氏佐剂对照组和Montanide ISA 206佐剂对照组，第Ⅳ组为reSjc HGPRT加弗氏佐剂免疫组，第Ⅴ组为reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组。每组10～12只小鼠。第Ⅳ和第Ⅴ组每只小鼠颈背部多点皮下注射乳化的20 μg重组抗原和弗氏或Montanide ISA 206佐剂，共免疫3次，间隔2周。其中第Ⅳ组小鼠第一次注射用佐剂为弗氏完全佐剂(FCA)，加强免疫时为弗氏不完全佐剂(FIA)。第Ⅱ组和第Ⅲ组小鼠则同法注射乳化的生理盐水加弗氏或Montanide ISA 206佐剂，感染对照组小鼠不注射任何抗原、佐剂或生理盐水。

　　1.4 攻击感染

　　末次免疫后2周，各组每只小鼠经腹部皮肤感染日本血吸虫尾蚴(30±1)条。攻击感染6周后剖杀小鼠，门静脉灌注收集虫体，计算减虫率和减雌雄合抱率。减雌雄合抱率(%)=(1-实验组平均检获雌雄合抱数/对照组平均检获雌雄合抱数)×100%。肝脏称重，加20～40 ml 8%的KOH，37 ℃，250 r/min消化3 h，取100 μl消化液涂片，在4倍光镜下进行虫卵计数，重复涂片3次，取均数，计算每克肝组织虫卵数(EPG)。

　　1.5 小鼠血清特异性抗体水平检测

　　分别于第一次免疫前、尾蚴攻击感染前和剖杀前，经小鼠尾静脉采血并分离血清，-20 ℃保存备用。采用酶联免疫吸附试验(ELISA)测定小鼠血清中特异性IgG抗体水平。reSjc HGPRT抗原2 μg/孔包被，加含5%小牛血清的0.01 mol/L PBS 37 ℃封闭2 h;加待测小鼠血清(1∶100稀释，稀释液为含5%小牛血清的PBS)，37 ℃孵育1 h，用PBST(0.1% Tween20)洗涤3次，每次5 min;加辣根过氧化物酶(HRP)标记的羊抗鼠IgG(1∶1 000稀释)，37 ℃孵育1 h;PBST洗涤3次，最后一次以PBS洗涤，加邻苯二胺(OPD)显色液显色，2 mol/L h3SO4 终止反应，测得各组光密度值[D(490 nm)]。

　　1.6 统计学分析

　　运用SPSS 11.0统计软件包对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，并进行t检验。

　　2 结 果

　　2.1 reSjc HGPRT重组抗原的鉴定

　　pET28aSjc HGPRT/BL21工程菌经IPTG诱导表达，表达产物经SDSPAGE分析表明，重组抗原Mr约29 000(含载体的6个组氨酸)，纯化的抗原纯度较高(图1)，浓度为2.58 mg/ml。

　　2.2 免疫保护作用

　　与感染对照组相比， reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组小鼠所检获成虫数最少，减虫率为53.7%(P&<0.05); reSjc HGPRT加弗氏佐剂组减虫率次之，为43.3%(P&<0.05);Montanide ISA 206佐剂组的减虫率也较低(P&<0.05)。reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组雌雄合抱减少率为59.3%;而reSjc HGPRT加弗氏佐剂组与感染对照组相比雌雄合抱减少率为44.1%(P&<0.05)。

　　与感染对照组相比，reSjc HGPRT加Montanide ISA 206佐剂免疫组肝脏减卵率最高，为44.9%(P&<0.05)、 reSjc HGPRT加弗氏佐剂免疫组减卵率为33.0%，Montanide ISA206佐剂对照组和弗氏佐剂组也有一定的减卵率(表1)。表1 日本血吸虫HGPRT重组抗原免疫小鼠减虫率、减雌雄合抱率和肝减卵率

　　2.3 ELISA检测免疫鼠血清特异性抗体(IgG)

　　末次免疫后7天，重组抗原加弗氏佐剂免疫组和重组抗原加Montanide ISA 206佐剂免疫组小鼠血清中特异性IgG水平明显升高，与感染对照组相比差异有统计学意义(P&<0.001);与弗氏佐剂对照组相比，抗体水平差异亦有统计学意义(P&<0.001)。而感染对照组小鼠免疫前、免疫后血清中特异性抗体IgG水平无明显变化(P&>0.05)。另外攻击感染后各组血清特异性抗体均升高(表2)。表2 ELISA检测免疫小鼠血清特异性IgG抗体: P&<0.001，与Ⅰ组相比;b: P&<0.001，与Ⅱ组相比;c:P&>0.05，d:P&<0.01，组内与免疫前相比

　　3 讨 论

　　疫苗被作为血吸虫病综合防治重要的措施之一而倍受关注，WHO专家认为，化疗手段(短效)必须与长效的措施(疫苗)相结合[2]，才能有效地控制血吸虫病，因此寻找新的疫苗候选抗原是当今血吸虫疫苗研究的热点之一。HGPRT是一种与调控细胞核苷酸代谢有关的酶，在血吸虫的体内有很高的活性，与血吸虫的生长发育有关。HGPRT通过嘌呤核苷酸补救途经形成核苷肌苷酸(IMP)或鸟苷酸(GMP)，是血吸虫体内鸟嘌呤和(或)次黄嘌呤合成鸟嘌呤核苷(guanosine monophosphate，GMP)必不可少的一种酶。HGPRT活性的丧失会直接导致寄生虫体内鸟嘌呤的缺乏，从而阻断DNA的合成，使寄生虫细胞不能分裂，无法发育[3，4]，从而导致细胞死亡，因而被认为是抗曼氏血吸虫病化疗有希望的靶抗原[5]。近来，在日本血吸虫的疫苗研究中发现，日本血吸虫HGPRT被证明存在于日本血吸虫SIEA中[6]。用日本血吸虫HGPRT重组蛋白免疫昆明鼠的研究发现，其减卵率水平较高[7]。

　　如何提高免疫保护效果一直是疫苗研究的热点。佐剂对免疫效果有一定的影响，依据免疫途径、免疫反应类型、免疫持续时间及抗原质量等因素的不同，选择合适的佐剂[8]，可增强疫苗的免疫原性，减少提供保护性免疫所需的抗原或接种次数，优化免疫应答，是有效提高重组抗原免疫保护力的手段之一。目前已使用的佐剂或增强剂有铝盐、矿物油、钙盐、胞壁酰肽、生物降解多聚体、微生物片段、多糖、细胞因子和纳米佐剂等[9]。弗氏佐剂是常见的一种，但鉴于弗氏不完全佐剂(FCA)毒副作用大及在机体内长期残留等难以解决的缺点，因此研究高效低毒的人用性佐剂不失为血吸虫免疫预防的有效途径[10]。Montanide ISA 206佐剂(人用)是一种水/油/水(W/O/W)型的新型佐剂，当油性佐剂与水相混合后便形成水包油乳剂，具有易乳化、黏性低、易注射等特点，W/O/W型的结构使得包含于外部水相中的抗原表位更突出，因而更容易被机体的免疫系统所识别;内部水相中的抗原能颗粒化而缓慢释放，所以它能够持续激发机体的免疫应答[11，12]。Montanide ISA 206与抗原乳化的研究表明，这种乳化剂完全可能保持持续的安全性，乳化物颗粒大小具有良好的可控性，抗原的使用剂量可限制至低量，且在乳化剂中稳定存在，可在人体使用。苏良科等[13]在研制预防猪链球菌病的亚单位疫苗中，经比较发现Montanide ISA 206佐剂的免疫增强作用要高于铝佐剂和CpG佐剂。因此，选择合适的佐剂有助于提高疫苗的免疫原性。

　　本研究在前期成功克隆表达日本血吸虫HGPRT重组蛋白的基础上，通过改变免疫方式，分别使用Montanide ISA 206佐剂、弗氏佐剂与重组蛋白一起免疫C57BL/6小鼠，大大提高了重组蛋白的免疫原性，诱导出小鼠体内较高水平的特异性IgG。并且重组蛋白加佐剂组诱导的免疫保护力均大大提高，减虫率、减雌雄合抱率和肝组织减卵率分别达到了53.7%、59.3%、44.9%和43.3%、44.1%、33.0%;减虫率均超过了40%。其中Montanide ISA 206佐剂与重组蛋白联合组免疫保护力更加明显，减卵率也超过了40%。因此，日本血吸虫在宿主肝的成熟虫卵数量减少，可能主要是血吸虫细胞中HGPRT分子受到干扰，使得核苷肌苷酸(IMP)或鸟苷酸(GMP)的合成受阻，从而导致雌虫子宫虫卵数、排卵数减少。而此保护力与其诱导的小鼠体内特异性IgG水平的升高有关。

　　本研究证实日本血吸虫HGPRT在抗生长发育及抗生殖效应方面是一个很有希望的疫苗候选分子，如果选用合适佐剂和免疫途径，可获得理想的免疫效果。进一步优化重组HGPRT抗原的免疫方案，包括理想的佐剂、佐剂使用量以及免疫途径等，正在进一步研究和验证中。

　　作为疫苗，安全性是不可忽略的一个环节。动物和人体内也存在HGPRT分子，并与血吸虫HGPRT分子有一定的同源性，如人体内HGPRT分子(GENE ID: 3251 HPRT1)与血吸虫HGPRT分子同源性达67%，是否会引起宿主的自身免疫反应?蔡胜蓝等[14]以血吸虫HGPRT的DNA疫苗进行家兔的局部肌肉刺激实验和豚鼠的全身过敏实验，结果肌肉刺激实验反应轻微，未出现变态反应。HGPRT分子作为候选疫苗的安全性值得进一步研究。

参考文献

　[1] 沈玉娟，夏超明，曹建平，等. 日本血吸虫HGPRT编码基因的克隆与表达[J]. 中国血吸虫病防治杂志， 2007，19(3):165-169.

　　[2] 曹建平，李小红，刘述先. 我国血吸虫疫苗研究进展和展望[J]. 中华传染病杂志， 2005，23(6): 418-420.

　　[3] Yuan L， Craig SP， McKerrow JH， et al. The hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase of Schistosoma mansoni. Further characterization and gene expression in Escherichia coli[J]. J Biol Chem， 1990， 265(23): 13528-13532.

　　[4] Yuan L， Wu CS， Craig SP， et al. Comparing the human and schistosomal hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferases by circular dichroism [J]. Biochim Biophys Acta， 1993， 1162(1/2): 10-16.

　　[5] Craig SP 3rd， Mckerrow JH， Newport GR， et al. Analysis of cDNA encoding the hypoxanthineguanine phosphoribosyltransferase (HGPRTase) of Schistosoma mansoni; a putative target for chemotherapy[J]. Nucleic Acids Res， 1988， 16(14B):7087-7101.

　　[6] 李文凯，汪世平，吕志跃，等. 日本血吸虫SIEA2628kDa的抗雌虫生殖免疫作用——HGPRT是否是主要的靶抗原(英文) [J].中国人兽共患病杂志， 2005，21(1):1-4.

　　[7] 余俊龙，汪世平，何 卓，等. 日本血吸虫中国株次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶的克隆、表达及其免疫保护性研究[J].生物化学与生物物理进展，2006，33(7):665-672.

　　[8] Aucouturier J， Dupuis L， Ganne V. Adjuvants designed for veterinary and human vaccines [J]. Vaccine，2001， 19(17-19):2666-2672.

　　[9] 罗永慧，易新元. 提高血吸虫疫苗保护性效果的研究进展[J]. 国外医学:寄生虫病分册，2004， 31(3):112-116.

　　[10] Keefer MC， Wolff M， Gorse GJ， et al. Safety and immunogenicity of Env23， a human immunodeficiency virus type I candidate vaccine， in combination with PPE/MF59[J].AIDS Res Hum Retroviruses，1997，13(14):1163.

　　[11] Ganne V， Eloit M， Laval A， et al. Enhancement of the efficacy of a replicationdefective adenovirusvectored vaccine by the addition of oil adjutants [J]. Vaccine，1994，12(13):1190-1196.

　　[12] Laval A， Ganne V， Aucouturier J， et al. Assessment of a new adjuvant range in a model for atrophic rhinitis[C]. Proceedings of the 15th IPVS Congress，Birmingham(England)，1998：5-9.

　　[13] 苏良科，陆承平. 类M蛋白亚单位疫苗的佐剂筛选[J].中国兽药杂志，2004，38(1):15-18.

　　[14] 蔡胜蓝， 向选东， 汪世平，等.抗血吸虫DNA疫苗pcDNA3/SjHGPRT局部肌肉刺激与全身过敏实验[J]. 中国人兽共患病学报， 2009， 25(6): 528-530.