蝙蝠葛酚性碱诱导多药耐药细胞系K562/MDR1凋亡及逆转耐药性的研究

　　　　　　 作者：何志一， 刘相辉， 刚宏林

【摘要】 目的： 探讨蝙蝠葛酚性碱(phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD)诱导多药耐药(multidrug resistance，MDR)细胞系K562/MDR1凋亡及逆转耐药性的作用。方法: 四甲基偶氮唑蓝(MTT)比色法检测K562/S及K562/MDR1细胞对不同浓度PAMD的敏感性，并计算半数抑制浓度(IC50)。膜联蛋白V (Annexin V)异硫氰酸荧光素(FITC)+碘化丙啶(PI)双参数检测细胞凋亡百分率变化，分析在PAMD的作用下，两种细胞对伊马替尼(IM，STI571)敏感性的变化。结果: PAMD可诱导两种细胞凋亡，其低剂量72 h时对K562/S和K562/MDR1细胞的凋亡率分别为(10.92±1.03)%和(8.12±0.98)%，并可提高伊马替尼对K562/MDR1的凋亡率。PAMD可显著逆转K562/MDR1细胞对伊马替尼的耐药性，其逆转倍数为2.22。结论: PAMD对K562/S和K562/MDR1细胞具有诱导凋亡作用，同时具有逆转白血病细胞株K562/MDR1多药耐药性、回归靶位的作用。

【关键词】 蝙蝠葛酚性碱; 慢性粒细胞白血病; 多药耐药细胞系; 凋亡

　　[Abstract] Objective: To study the effects of phenolic alkaloids from Menispermum dauricum(PAMD) on inducing the multidrug resistance (MDR) cell line K562/MDR1 to apoptosis and reversing their MDR. Methods: MTT colorimetric assay was employed to detect the sensitivity of K562/S and K562/MDR1 cell lines treated with PAMD of different concentration for 72 h. IC50 values of PAMD were analyzed by MTT assay. The apoptosis rates of the two cell lines were detected by Annexin V/PI to analyze the sensitivity of two cell lines treated with PAMD on imatimib mesylate (IM，STI571). Results: PAMD can induce the apoptosis of the two kinds of cells and the apoptosis rates of the two cell lines were (10.92±1.03)% and (8.12±0.98)% respectively. It was also able to enhance the apoptosis rates of K562/MDR1 on IM. PAMD could reverse MDR of K562/MDR1 on IM and its reversal multiple was 2.22. Conclusion: PAMD could induce K562/S and K562/MDR1 to apoptosis and reverse MDR of K562/MDR1 on IM and recur its target.

　　[Key words] phenolic alkaloids from Menispermum dauricum(PAMD); chronic myelogenic leukemia; multidrug resistance cell line; apoptosis

　　多药耐药(multidrug resistance，MDR)是指肿瘤细胞对一种化疗药物产生耐药的同时，对其他结构和作用机制不同的化疗药物也产生交叉耐药的现象，它是导致肿瘤化疗失败的原因之一[1]。克服MDR的方法之一是使用逆转剂，一些具有钙拮抗作用的逆转剂(异搏定、维拉帕米)作用较温和，能在逆转MDR中提高化疗效果，是一类具有很好应用和开发前景的药物。本实验选用具有钙通道阻滞作用的中药蝙蝠葛酚性碱(phenolic alkaloids from Menispermum dauricum，PAMD)进行逆转耐药性的研究，以期寻找克服MDR、提高化疗疗效和对耐药肿瘤细胞进行更有效杀伤作用的新型药物。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 细胞培养 人红白血病敏感细胞株K562/S购自中科院上海细胞所，多药耐药细胞株K562/MDR1由江苏血液研究所陈子兴教授惠赠。两种细胞于含10%小牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中，在37 ℃、5%CO2饱和湿度培养箱内传代培养。

　　1.1.2 主要试剂与仪器 蝙蝠葛酚性碱由黑龙江中医药大学药学院王栋教授提供，RPMI1640培养基(Gibco公司)，小牛血清(杭州四季青生物材料工程公司)，四甲基偶氮唑蓝(MTT，Sigma公司)，二甲基亚砜(DMSO，北京化工厂);酶标仪(DG3022，华东电子管厂)，EPICSXL型流式细胞仪(Beckman Coluter公司);膜联蛋白V (Annexin V)-异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)试剂盒购于BD Pharmingen公司。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡百分率 取对数生长期的K562/S和K562/MDR1细胞，调整细胞的初浓度，实验组分别加入PAMD至终浓度为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 mg/L，阴性对照组加入等体积的RPMI 1640培养基。置37 ℃、5%CO2培养箱培养72 h，收集细胞，用预冷的1×PBS洗2次，每管用1×结合缓冲液把细胞调整成1×106浓度，每管取100 μl加入5 μl的AnnexinVFITC溶液进行染色，轻轻混匀，再加入5 μl的PI溶液染色，双染后在室温避光静止15 min后每管再加入1×结合缓冲液400 μl，在1 h内上流式细胞仪进行凋亡检测。凋亡后继发坏死细胞既有膜生化改变又有膜通透性改变，AnnexinVFITC+，PI+;坏死细胞呈AnnexinVFITC-，PI+;正常细胞呈AnnexinVFITC-，PI-;AnnexinVFITC+，PI-为早期凋亡细胞。每份标本设一个复管，重复1次，计算凋亡细胞百分数。

　　1.2.2 MTT法测定PAMD和伊马替尼(IM，STI571)的细胞毒性[2] 取对数生长期的K562/S和K562/MDR1细胞，配制成1×105/ml单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔0.1 ml，实验组分为两组，一组加入PAMD至终浓度为40，20，10，5，2.5，1.25，0.625 mg/L，另一组加入STI571至终浓度为5，2.5，1.25，0.625，0.315 μmol/L，每个药物浓度设6个复孔，空白对照组不加药，置于37℃饱和湿度5% CO2条件下常规培养72 h，每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，再置37 ℃、5% CO2培养箱内继续培养4 h。吸取上清液，每孔加入100 μl DMSO振荡5 min，用酶联仪在570 nm波长下测光密度，同时计算各组细胞的半数抑制浓度(IC50)，按下列公式计算耐药细胞的耐药倍数。同时测定PAMD的IC10，选取低于IC10的药物浓度进行逆转研究[3]。

　　耐药倍数=耐药细胞的IC50/敏感细胞的IC50。

　　1.2.3 MTT法测定细胞的药敏性 取对数生长期的K562/MDR1细胞，配制成1×105/ml 单细胞悬液，接种于96孔培养板，每孔0.1 ml，各组加入STI571至终浓度为5，2.5，1.25，0.6，0.3 μmol/L，同时每组加入终浓度为0.625 mg/L的PAMD逆转剂，每个药物浓度设6个复孔。同“1.2.2”方法测定D/(570) nm，按STI571浓度抑制率曲线计算出IC50，求出逆转剂PAMD作用后的逆转倍数。

　　逆转倍数=耐药细胞逆转前的IC50/耐药细胞逆转后的IC50

　　1.2.4 流式细胞术(FCM)检测逆转后耐药细胞的凋亡百分率 取对数生长期的K562/MDR1细胞，调整细胞的初浓度，实验组分别加入STI571至终浓度为5，2.5，1.25，0.625，0.315 μmol/L，同时每组加入终浓度为0.625 mg/L逆转剂，阴性对照组加入等体积的RPMI1640培养基。置37℃、5%CO2培养箱培养72 h后收集细胞，AnnexinVFITC/PI双染后上流式细胞仪进行检测，每份标本设一个复管，重复1次，计算凋亡细胞百分数。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS 13.0 软件包处理，数据以±s表示，t检验计算比较实验和对照各组的D值。采用线性回归计算IC50。

　　2 结 果

　　2.1 PAMD诱导后K562/S和K562/MDR1细胞凋亡百分率 AnnexinVFITC/PI双参数检测肿瘤细胞的凋亡情况，细胞凋亡流式散点图上可见实验组细胞凋亡明显高于对照组，低浓度的PAMD(0.625～10.0 mg/L)作用72 h凋亡细胞百分率呈剂量依赖性，Ⅳ象限细胞(FITC+，PI-)增加并随药物浓度递增比例提高，当剂量大于10 mg/L时，Ⅱ象限(PI+，FITC+)凋亡后坏死细胞和部分坏死细胞明显增多(图1)。凋亡率为Ⅳ象限细胞占全部细胞的百分率(表1)。表1 蝙蝠葛酚性碱诱导K562/MDR1和K562/S细胞凋亡率的影响

　　2.2 PAMD和STI571的细胞毒性及耐药细胞的耐药倍数 PAMD和STI571分别对K562/MDR1和K562/S细胞都存在显著的细胞毒性作用，且呈明显的量效关系。不同浓度的PAMD和STI571对亲本细胞和耐药细胞的抑制率曲线见图2，图3。通过回归方程计算PAMD对K562/MDR1和K562/S的IC50分别为11.57 mg/L和7.59 mg/L，两者比较差异无统计学意义(P&>0.05)，说明K562/MDR1细胞对PAMD没有耐药性。同时测得STI571对K562/MDR1和K562/S的IC50分别为8.27 μmol/L和1.83 μmol/L，即K562/MDR1细胞对STI571的耐药倍数为4.52倍。

　　2.3 细胞药敏性及对耐药细胞的逆转倍数

　　PAMD对K562/MDR1的IC10为0.632 mg/L，因此把低于IC10剂量(0.625 mg/L)的PAMD作为最佳逆转浓度。STI571单独作用于K562/MDR耐药细胞72 h的IC50为8.27 μmol/L，STI571与低于IC10剂量的PAMD共同作用72 h后，K562/MDR1耐药细胞的IC50降低为3.72 μmol/L，但仍远远高于对敏感细胞K562/S的值1.83 μmol/L，STI571对多耐药细胞K562/MDR逆转倍数为2.22倍(图4)。

　　2.4 逆转后耐药细胞K562/MDR1的凋亡率

　　各浓度的STI571与0.625 mg/L的PAMD联合应用作用于多药耐药K562/MDR1细胞72 h后，K562/MDR1未处理组自然凋亡率为(3.05±0.05)%，STI571的各浓度单独应用以及与0.625 mg/L的PAMD联合应用结果见表2。由此可见，当STI571与低于IC10剂量的PAMD联合应用时，可以显著提高K562/MDR1细胞的凋亡率(P&<0.01)。表2 PAMD对逆转后耐药细胞K562/MDR1凋亡率的影响

　　3 讨 论

　　肿瘤多药耐药的实质是肿瘤细胞对治疗药物的防御与适应的一种反应。自从Biedle发现多药耐药现象以来，国内就对肿瘤细胞多药耐药的逆转进行热点研究。目前研究发现，药物分布及摄取、代谢与失活、药物作用效靶、DNA损伤与修复以及凋亡途径改变等多种机制参与多药耐药的形成，其中主要机制之一是细胞过量表达了一种P糖蛋白(Pglycoprotein，Pgp)，它通过消耗ATP主动把细胞内化疗药物从细胞内快速“泵出”，使细胞内药物浓度下降，导致细胞内药物聚集减少，从而产生多药耐药性。在体外具有逆转肿瘤多药耐药作用的耐药调节剂主要包括:钙通道阻滞剂(异博定)，钙调蛋白拮抗剂(三氟丙嗪)，免疫调节剂(环孢素A)，抗生素类(红霉素)以及干扰素(IFNα)等。尽管体外实验证明这些药物能够逆转肿瘤化疗药物的耐药，但它们在临床应用时多受到禁忌证多、不良反应大、药效不稳定、难以作用到靶点等因素的影响。如异博定、环孢素A等虽然已经进入临床试验阶段，但是它们明显的不良反应限制了临床应用，疗效也不是很理想[4]。因而迫切需要寻找其他治疗指数更大、确有临床价值的化疗增敏剂。

　　研究证实，钙拮抗剂通过破坏Pgp的功能，竞争性抑制Pgp的外排而逆转多药耐药，从而达到增强化疗效果的目的[5]。研究发现，钙通道阻滞剂异喹啉类生物碱具有一定的逆转肿瘤细胞耐药的作用。田晖等[6]研究发现双苄基异喹啉生物碱——蝙蝠葛碱和蝙蝠葛苏林碱对天然耐药的BEL7402细胞和获得性耐药的MCF7/Adr、KBV200细胞均有明显逆转多药耐药作用。田春艳等[7]在对从中药功劳木的根中提取的一种异喹啉类生物碱研究发现，它能增加多柔比星对K562/ADM的细胞毒作用，提高其对耐药细胞K562/ADM的杀伤性，部分逆转了K562/ADM细胞的耐药。

　　蝙蝠葛酚性碱(PAMD) 是从中药蝙蝠葛(Menispermum dauricum，DC) 根茎中提取的多种脂溶性生物碱的混合物，实验已证明其主要成分为蝙蝠葛碱(dauricine，Dau)和蝙蝠葛苏林碱(daurisoline，DS)，Dau和DS均为双苄基异喹啉类生物碱，脂溶性高，具有抗钙活性[1]。本实验采用AnnexinV/PI 双标记流式细胞术研究PAMD对K562/S和K562/MDR1细胞的凋亡影响及其对多药耐药的逆转作用。结果表明，PAMD能够明显促进亲本细胞和耐药细胞早期凋亡，PAMD在0.625～10.0 mg/L低浓度组之间随着剂量的增加，K562/S和K562/MDR1细胞的凋亡比例显著增加，此时细胞凋亡比例已达到高峰。当浓度大于10 mg/L时细胞的凋亡比例却随之下降，此时不是凋亡减少，而是凋亡细胞转化为死亡细胞的结果，这可能是因为PAMD本身具有一定的细胞毒性作用，随着PAMD浓度的增加，它的细胞毒作用就愈强，加速凋亡细胞坏死，并使大量细胞直接发生核固缩坏死。PAMD在低于IC10的剂量(0.625 mg/L)时能显著增强STI571对K562/MDR1的细胞毒性，同时提高STI571对K562/MDR1的凋亡率，逆转了K562/MDR1对STI571的耐药，其逆转倍数为2.22。但PAMD对MDR作用是否与其抑制钙离子通道，从而抑制Pgp药泵作用有关等分子生物学机制及体内逆转效应的研究有待于进一步研究。

参考文献

　　[1] Arora A， Seth K， Shukla Y. Reversal of Pglycoproteinmediated multidrug resistance by diallyl sulfidein K562 leukemic cells and in mouse liver[J]. Carcinogenesis，2004， 25(6):941-949.

　　[2] Mosman T. Rapid colorimetric assay for cellular growthand survival:application to proliferation and cytotoxicity assays[J].J Immunol Methods， 1983， 65(1-2):55-63.

　　[3] 栾凤君，杨纯正，马建国，等.一株人红白血病多药耐药细胞系(K562/A02)的建立及其耐药特性的研究[J].中华肿瘤杂志，1993，15(2):101-102.

　　[4] Davidson A，Dick G， PritchardJones K， et al. EVE/cyclosporin (etoposide， vincristine， epirubicin with highdose cyclosporin) chemotherapy selected for multidrug resistance modulation[J]. Eur J Cancer，2002，38 (18):2422-2427.

　　[5] Kartner N，Riordan JR，Ling V.Cell surface Pglycoproteim is associated with multidrug resistance in mammalian cell lines [J].Science，1983，221(4617):1285-1288.

　　[6] 田 晖，潘启超.双苄基异喹啉生物碱蝙蝠葛碱与蝙蝠葛苏林碱逆转多药耐药性的比较研究[J].癌症，1996，15(6):410-414.

　　[7] 田春艳，张凤春，林玉梅，等.中药MBC逆转K562/ADM细胞的体外研究[J].中国医师杂志，2004，6(3):307-309.