应用超声心动图观察褪黑素对糖尿病大鼠心脏的保护作用

　　　　 作者：汪健飞，方春钱， 陈魁， 高静， 张国辉

【摘要】 　　目的： 观察褪黑素（MT）对链脲佐菌素（STZ）诱导的糖尿病大鼠心脏的保护作用，探讨超声心动图对糖尿病心肌病的早期诊断价值。方法： STZ 诱导糖尿病大鼠模型，将成模糖尿病大鼠随机分为糖尿病组和褪黑素干预组，并以正常组作对照。MT干预8周后，测定血糖、血压、氧化指标丙二醛（MDA）、抗氧化指标超氧化物歧化酶（SOD）；超声心动图观察各组大鼠心脏结构及功能改变，HE染色观察心肌组织。结果： 与正常组比较，糖尿病组血压水平、MDA含量升高（P&<0.05），SOD水平降低（P&<0.05），心脏舒张和收缩功能降低（P&<0.05）；与糖尿病组相比，褪黑素干预组MDA含量有所降低（P&<0.05），SOD水平上升（P&<0.05），心脏收缩功能改善（P&<0.05），舒张功能继续恶化，病理情况有所好转。结论: MT能调节氧化抗氧化系统平衡，对糖尿病大鼠心脏有一定的保护作用；超声心动图可用于观察心脏结构、功能的改变，从而早期诊断糖尿病心肌病。

【关键词】 超声心动图； 褪黑素； 糖尿病； 心脏

　　［Abstract］Objective: To observe the effect of melatonin(MT) on streptozotocin(STZ)induced diabetic rat heart and the early diagnosis value of echocardiography in diabetic cardiomyopathy.Methods： STZinduced diabetic rats were randomly pided into diabetic group and MT intervention group(intervention with MT for 8 weeks)， and the normal group as control. The blood pressure， blood glucose levels， oxidation of malondialdehyde(MDA)， antioxidation of superoxide dismutase(SOD) were detected; myocardial pathology was observed by HE staining; structure and function of rat heart were valued by echocardiography. Results: Compared with normal control group，It was found that of diabetic group the blood pressure and MDA increased（P&<0.05）and the diastolic and systolic function of left ventricular and the SOD level decreased（P&<0.05）.Conversely，compared with diabetic group，of the MT intervention group the MDA level decreased（P&<0.05） and the SOD level and EF values increased（P&<0.05）and the diastolic function continues to deteriorate， but the pathological situation was improved. Conclusion: MT protected the heart of STZ induceddiabetic rats by adjusting oxidationantioxidation balance; Echocardiography probably be useful for early diagnosis of diabetic cardiomyopathy by observation changes of cardiac structure and function.

　　［Key words］echocardiography； melatonin； diabetes mellitus； heart
　　
　　随着人类物质的富裕和生活方式的变迁，糖尿病的患病率正明显上升，它具有多种慢性并发症，遍及全身各重要器官，是糖尿病患者致死致残的最主要的原因［1］。而细胞凋亡参与了多种慢性并发症的发生和发展。另外自由基及其清除系统的异常在2型糖尿病微血管并发症的发生及发展中起重要作用［2］。褪黑素(melatonin，MT)是由松果体分泌的一种神经内分泌激素，是一种抗氧化作用很强的自由基清除剂［3］，研究表明MT对糖尿病大鼠肾病，血脂改变等有显著作用［4，5］。本文观察褪黑素对糖尿病大鼠心脏损伤的保护作用，并应用超声心动图检测糖尿病大鼠心脏结构和功能的改变，探讨其对糖尿病心肌病的早期诊断价值，现报告如下。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验动物和仪器
　　
　　MT为Sigma进口分装。雄性SD大鼠39只，体质量170～210 g，2～3月龄，由扬州大学比较医学中心提供，合格证号SCXK（苏）20070001。生化指标检测试剂盒购自上海合富公司，超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）测定试剂盒购自南京建成生物工程研究所，血糖试纸购自雅培公司。彩色多普勒超声诊断仪为HP SONOS 5500（美国惠普公司），探头为S12型。
　　
　　1.2 动物分组及处理
　　
　　健康雄性SD大鼠随机分为正常对照组（n=9）和糖尿病模型组（n=30）。造模大鼠给予腹腔注射链脲佐菌素65 mg/kg，对照组大鼠给予相同体积枸橼酸钠缓冲液腹腔注射。1 周后测定血糖，以血糖大于16.8 mmol/L确定为糖尿病模型大鼠，成模率为67%。
　　
　　将造模成功大鼠随机分为两组：糖尿病组（n=10）和褪黑素干预组（n=10）。褪黑素干预组给予MT 10 mg/kg(溶质为含10%乙醇的生理盐水）腹腔注射，对照组和糖尿病组大鼠给予等体积含10%乙醇的生理盐水腹腔注射。每日下午4点给药，持续给药8周。于实验结束时禁食12 h，麻醉，腹主动脉采血，分离血清测定MDA，SOD；迅速取出心脏，固定后HE染色观测。
　　
　　1.3 心脏超声检测
　　
　　给药8周后即行超声心动图检查，麻醉大鼠，褪去前胸部皮毛，取左室短轴观、胸骨旁左室长轴观及心尖四腔观，以M型超声模式测量左室舒张末期内径（LVEDD）、左室收缩末期内径（LVESD），计算左室射血分数（LVEF）和左室短轴缩短率（LVFS）。
　　
　　1.4 血压、心率检测
　　
　　大鼠体温用电热垫维持在37℃，采用MPA多道生物信号分析系统观测记录收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、平均压（MBP）和心率（HR）的变化。
　　
　　1.5 氧化指标MDA、抗氧化指标SOD检测
　　
　　采用MDA，SOD测试盒(南京建成生物工程研究所产品)，按照说明书操作方法进行测定。
　　
　　1.6 组织形态学检测
　　
　　取心脏组织，中性甲醛溶液常规固定、脱水、石蜡包埋、切片（5 μm），常规行HE染色，光镜下观察组织切片，用Leica QWIN3自动图像分析系统摄片。
　　
　　1.7 统计方法
　　
　　所有数据用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，计量资料以均数±标准差(±s)表示，α=0.05为显著性水平。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 各组大鼠一般状况
　　
　　糖尿病组大鼠死亡3只，褪黑素干预组大鼠死亡2只。褪黑素干预组大鼠外观与糖尿病组类似，但毛色、活动性等表现较糖尿病组均有所改善。
　　
　　2.2 超声心动图检测结果
　　
　　与对照组比较，糖尿病组和褪黑素干预组大鼠LVEDD，LVEF和LVFS均显著降低(P&<0.05)；与糖尿病组比较，褪黑素干预组LVEF和LVFS都显著升高（P&<0.05)，但仍低于正常大鼠（表1）。图1为各组大鼠超声心动图检测结果。表1 第8周各组大鼠心脏功能变化（略）
　　
　　2.3 各组大鼠血压及心率的变化
　　
　　与对照组比较，糖尿病组大鼠SBP，DBP和MBP都显著升高（P&<0.05），HR显著降低（P&<0.05）；褪黑素干预组大鼠与对照组比较SBP，DBP，MBP和HR均无显著差异（P&>0.05），而与糖尿病组比较，褪黑素干预组大鼠SBP，DBP和MBP都显著降低（P&<0.05），HR显著升高（P&<0.05）。见表2。表2 第8周各组大鼠血压变化结果（略）
　　
　　2.4 各组大鼠MDA，SOD测定结果
　　
　　与对照组相比，糖尿病组大鼠血清中SOD活性下降（P&<0.05）；与糖尿病组相比，褪黑素干预组大鼠血清中SOD活性显著升高（P&<0.05），但是和对照组相比仍然有显著性差异（P&<0.05）（图2a）。
　　
　　血清中MDA含量检测结果显示：与对照组相比，糖尿病组大鼠MDA含量显著上升（P&<0.05）。与糖尿病组相比，褪黑素干预组大鼠MDA含量显著下降（P&<0.05），和对照组相比没有显著性差异（图2b）。

　　2.5 各组大鼠的组织病理学变化
　　
　　HE染色结果显示，对照组心肌细胞结构纹理清晰，肌丝排列整齐；糖尿病组大鼠心肌肌丝排列紊乱、扭曲、断裂，肌浆凝集，间质水肿；褪黑素干预组大鼠心肌纹理一定程度上恢复正常，趋于清晰，间质水肿有所减轻(图3)。
　　
　　3 讨论
　　
　　褪黑素具有抗氧化作用及高度的弥散穿透能力，可以在细胞膜、细胞质和细胞核中发挥其抗氧化作用，从而保护机体免受氧化损伤，起到保护心脏的作用。褪黑素也是一种心肌局部缺血后再灌注的有效保护因子，能有效地保护心脏抵制再灌注的损伤［6］。研究也证实褪黑素具有降低血糖的作用，其作用机制涉及葡萄糖的利用、胰岛素敏感性、胰岛素合成分泌、升血糖激素水平改变等多方面的因素。
　　
　　正常生理情况下，体内存在清除自由基的抗氧化酶系统，维持自由基产生和清除的动态平衡。糖尿病患者MDA和活性氧含量增加［7］。MDA是 ROS引发脂质过氧化反应的高毒性副产物，它可损伤生物膜脂质双分子层结构，细胞膜上脂质过氧化反应增强使其浓度增高［6］。因此，MDA的含量常可反映体内脂质过氧化损伤的程度以及氧化应激的水平，间接地反映出组织损伤的程度。SOD是内源性抗氧化系统中抗氧化酶之一，其重要作用在于清除带电荷的氧自由基［8］。本组糖尿病组大鼠血清MDA与对照组比较明显升高， 而SOD则显著降低。褪黑素干预后，MDA明显下降，SOD上升，差异均有统计学意义。
　　
　　超声心动图是一种简便、价廉、多用途的、可重复性好的检测手段，可以非侵袭性地判断组织结构和功能，在判断糖尿病大鼠左室功能失调方面非常有用。本研究显示，在链脲佐菌素诱导糖尿病大鼠成模8周后，模型大鼠出现了糖尿病心肌病变。与正常组大鼠相比，糖尿病组大鼠LVEDD显著降低，表明链脲佐菌素所致糖尿病心肌病早期主要导致舒张功能进行性受损、顺应性下降，与文献结果一致［9-10］，并且完全不可逆，给予褪黑素之后仍没有改善，继续恶化。之后由于心肌进行性纤维化，最终导致不完全可逆性心脏收缩功能降低，表现为LVEF，LVFS值降低，给予褪黑素之后心脏的收缩功能得到改善，LVEF值上升，但与正常组相比仍有差别，表明仍没有恢复到正常状态。同时病理检查结果反映出糖尿病组大鼠的心脏组织形态结构发生了严重的损伤，与超声心动图反映的心脏功能和心脏组织形态学的改变具有一致性。
　　
　　本研究描述了超声心动图作为一种非侵袭性手段评价链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠心脏功能的价值。研究表明糖尿病心肌病是一种特殊疾病，在临床症状出现之前左室功能已经受损，这一时期称为临床前期，是可以被非侵袭性的检测手段检测的［11］。由于糖尿病患者左室舒张功能受损出现在糖尿病心肌病的最初阶段，这也强调了早期检测左室舒张功能的重要性［12］。运用超声心动图动态检测LVEDD可以观察糖尿病心肌病的病情进展，从而为临床预防和早期诊断糖尿病心肌病提供有效的理论依据和检测手段。

参考文献

　　［1］Clark MJ Jr， Sterrett JJ， Carson DS. Diabetes guideline: a summary and comparison of the recommendations of the American Diabetes Association， Veterans Health Administration， and American Association of Clinical Endocrinologists［J］. Clin Ther， 2000，22(8):899-910.

　　［2］Nishikawa T， Edelstein D， Brownlee M. The missing link: a single unifying mechanism for diabetic complications［J］. Kidney Int Suppl， 2000，77:S26-30.

　　［3］Carretero M， Escames G， López LC， et al. Longterm melatonin administration protects brain mitochondria from aging［J］. J Pineal Res， 2009，47(2):192-200.

　　［4］Cam M， Yavuz O， Guven A， et al. Protective effects of chronic melatonin treatment against renal injury in streptozotocininduced diabetic rats［J］. J Pineal Res， 2003，35(3):212-220.

　　［5］Sudnikovich EJ， Maksirachik YZ， Zabrodskaya SV， et al. Melatonin attenuates metabolic disorders due to streptozotocininduced diabetes in rats［J］. Eur J Pharmacol， 2007，569(3):180-187.

　　［6］Winiarska K， Fraczyk T， Malinska D， et al. Melatonin attenuates diabetesinduced oxidative stress in rabbits［J］. J Pineal Res， 2006，40(2):168-176.

　　［7］West IC. Radicals and oxidative stress in diabetes［J］. Diabet Med， 2000，17(3):171-180.

　　［8］Ames BN， Shigenaga MK， Hagen TM. Oxidants， antioxidants， and the degenerative diseases of aging［J］. Proc Natl Acad Sci U S A， 1993，90(17):7915-7922.

　　［9］Francis GS. Diabetic cardiomyopathy: fact or fiction?［J］.Heart， 2001，85(3):247-248.

　　［10］Sowers JR， Epstein M， Frohlich ED. Diabetes， hypertension， and cardiovascular disease: an update［J］. Hypertension， 2001，37（4）:1053-1059.

　　［11］Seneviratne BI. Diabetic cardiomyopathy: the preclinical phase［J］. Br Med J， 1977，1（6074）:1444-1446.

　　［12］Poirier P， Bogaty P， Garneau C， et al. Diastolic dysfunction in normotensive men with wellcontrolled type2 diabetes：importance of maneuvers in echocardiographic screening for preclinical diabetic cardiomyopathy［J］. Diabetes Care， 2001，24（1）:5-10.