大鼠心脏腹部和颈部移植模型的建立与比较

　　　　　　 作者：周小兵， 蒋美芳， 徐三荣， 邵启祥

【摘要】 目的： 寻求一种简洁、有效的大鼠异位心脏移植模型，作为器官移植的实验研究方案。方法： 受体手术先进行至准备缝合。供体冰块腹部降温至双腋部低温后，打开胸腔，置入冰水快速致心跳停止，单人直视下缝合。腹部模型在Ono法的基础进行改进，将改进后的腹部心脏移植与颈部心肺联合移植方法进行比较。 结果： 腹部模型手术成功率93.2%(68/73)，颈部心肺联合模型成功率80.9%(38/47)，腹部移植成功率较高(P&<0.05)。但两组的手术用时差异无统计学意义(P&>0.05)。结论： 腹部心脏移植能简化手术操作步骤，增加手术成功率。但颈部心肺联合移植能提供再次移植机会。

【关键词】 心脏移植; 模型; 大鼠

　　[Abstract] Objective: To develop a rat model of heterotopic heart transplantation with high postoperative survival rate by using the simplified surgical technique， for further studies on transplantation immunology， pathology and organ protection.Methods： The operation on recipients went fist so that the vessels could be anastomosed right after donor′s heart had been cut off. Donor′s temperature decreased by saline ice cube placed in abdomen until its axillary fossa felt cold， then the thoracic cavity was opened to stop heartbeat quickly by ice physiological saline. Whole process was mainly completed by a single man without microscope assistance. Development of abdominal heart transplantation took place on the base of Ono′s procedure. Developed abdominal heart transplantation was compared with cervical heartlung transplantation. Results： The success rate of abdominal heart transplantation was up to 93.2%(68/73) versus 80.9%(38/47) in the cervical group(Chisquare test， P&<0.05) . And， there′s no significant difference between two groups in operating time(group ttest， P&>0.05). Conclusion： The advantage of developed abdominal heart transplantation lies in simplifying the procedure and succeeding highly. But cervical heartlung transplantation has a chance to undergo second grafting.

　　[Key words] heat transplantation; model; rat

　　在移植免疫研究中，建立动物模型是一项必不可少的方法。Ono等[1]创建的大鼠心脏异位移植模型被认为是理想的心脏移植模型，已被用于移植免疫、缺血再灌注等多种研究中。但其仍存在手术操作复杂、要求具备手术显微镜和良好血管缝合技术等缺陷。本实验室根据已有的心脏移植制作经验[2]，对Ono等创建的术式进行了改良，并与颈部心肺联合移植术式进行比较。现将我们的实验结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验材料

　　健康雄性SD大鼠(江苏大学实验动物中心)。腹部吻合组：供体体质量186～201 g，受体体质量195～209 g;颈部吻合组：供体体质量135～154 g，受体体质量257～303 g。常规手术器械;显微手术器械包;80，100缝合线。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 腹部心脏移植模型的建立

　　1.2.1.1 受体手术 受体以1%戊巴比妥(40 mg/kg)腹腔注射，麻醉成功后，固定于自制手术台，碘酒、乙醇消毒后，眼科剪沿正中剪开皮肤、肌层及腹膜，30丝线缝吊皮肤和腹壁于两侧的钉柱上将切口牵开。将大鼠的肠管向左上翻出腹腔外，用湿生理盐水纱布包裹。将直肠移向左侧从而显露出大鼠腹部血管及分支，沿腹主动脉走向钝性分开后腹膜，注意不能损伤腹主动脉和下腔静脉两侧的输尿管、走向下肢的神经。不需要将腹主动脉和下腔静脉分离，40丝线结扎其背侧分支1～2支。左右分支1～2支活结结扎，使其肾血管平面以下有1 cm左右无血管分支段以便上血管夹。头、尾端套30丝线，打单结以便牵提。

　　1.2.1.2 供体手术 供体大鼠麻醉成功后，同样固定于自制手术台。颈、胸、腹部消毒后，沿下中剪开腹部皮肤直至颈部。剪开腹壁，显露下腔静脉后，1 ml注射器抽取0.2 ml(250 U/ml)肝素生理盐水注入。干棉球压迫后腹腔，置入大块生理盐水冰块，向上推至肝下。等待3～5 min，手指检测大鼠双侧前肢腋窝温度明显降低后，即可沿胸骨正中剪开胸腔至颈部。快速注入冰(0℃)生理盐水后，取小冰块压在心脏的右侧面，心脏跳动3～5次后即能很快停止。剪断两侧膈肌，将胸骨及肋骨用中号直血管钳夹住翻向两侧。再加入小冰块，使心脏浸泡于冰水中。去除心脏前胸腺组织，先分离出右上腔静脉，于近右心房入口处以40丝线结扎后切断;分离出主动脉，距心脏2 mm左右处切断，分离肺动脉，于左右肺动脉分叉处切断。中号弯血管钳夹住左上腔静脉、膈上下腔静脉后，下腔静脉剪开小口。20 ml注射器抽取冰生理盐水分别从右肺动脉远端口、下腔静脉切口、主动脉近端口冲洗心腔和冠脉中的积血，至流出液变清。然后用40丝线整体结扎。剪断肺静脉、上下腔静脉，取出心脏，置入冰生理盐水中，并用小片纱布包裹。

　　1.2.1.3 供心移植 用1 ml注射器抽取0.2 ml(50 U)肝素后再抽取生理盐水至0.5 ml，于受体大鼠下腔静脉预切开点穿入，缓慢注入。干棉球压迫后即于腹主动脉和下腔静脉远近端分别上血管夹，于腹主动脉预缝心脏点前外侧用0.45 mm针头穿孔后，显微手术剪剪开2 mm左右(稍小于供心主动脉口)，将供心置于切口左侧，上置生理盐水冰块。用80显微缝合线从腹主动脉切开顶点右侧进针，按顺时针方向将供心主动脉和腹主动脉连续缝合。针距和边距各为0.5 mm左右。打结前腹腔注入少量生理盐水浸泡吻合口以驱除血管内空气。缝合完成后将近端血管夹稍试开放即再夹闭，检查是否有漏血。如有漏血，于渗漏处修补止血。于肺动脉对应处下腔静脉前外侧用显微手术剪剪开血管壁，切口2～3 mm，稍小于肺动脉开口。用100缝合线于切口顶端右侧按顺时针连续缝合，在两端重复缝合以预防漏血，远端血管夹试开放，检查有无漏血。吻合完成后，按先远端后近端顺序开放血管夹，如还有少量渗血，予以干棉球轻压。去除包裹纱布和生理盐水冰块，1～3 min后心脏便可复跳。待无明显出血，心跳稳定后，去除两侧分支血管结扎线，将肠管按系膜走向顺序还纳腹腔，并注入少量生理盐水以防止肠粘连。切口两侧腹部皮下多点注射含抗生素(头孢哌酮40 mg/kg)生理盐水2～3 ml。40线连续缝合腹壁肌层及腹膜、间断缝合皮肤，皮肤再次用乙醇消毒后，仰卧位待其自然清醒。

　　1.2.2 颈部心肺联合移植模型的建立

　　1.2.2.1 受体手术 受体鼠麻醉后仰卧位，头部及四肢固定于手术台，颈、胸部皮肤消毒。自下颌骨至右锁骨中线斜向切开皮肤，游离皮下组织。切除右颌下腺及一部分脂肪组织，结扎、切除右胸锁乳突肌，显露颈动脉鞘，分离出颈总动脉0.8 cm左右，两端血管夹阻断，0.45 mm针头穿孔后显微剪剪开2 mm，肝素生理盐水冲洗管腔，湿盐水纱布覆盖切口。

　　1.2.2.2 供体心肺手术 同腹部心脏移植模型的供体手术，显露主动脉并切断后，冰盐水冲洗心腔、冠脉，结扎、切断左右上腔静脉及下腔静脉。结扎切除左肺、右肺尖叶、心叶、膈叶，保留副叶。取出心肺置于冰生理盐水中，纱布包裹。

　　1.2.2.3 心肺缝合 纱布包裹带肺心置于受体颈部，调整好供心位置后，直视下80无损伤线端-侧缝合供心主动脉于受体鼠颈总动脉。试开放及补针至无出血后缝合皮肤。

　　1.2.3 观察和饲养 术后单独饲养。禁食禁水12 h，观察到大鼠有数粒排便后可予正常水和食物。术后第2天开始每天2次触摸心脏跳动情况，移植心脏成活72 h以上视为手术成功。

　　1.2.4 统计学处理 取心时间、血管吻合时间、总体手术时间采用方差齐性分析后成组t检验， 成功率用非参数χ2方法分析。数据采用±s表示， 检验水准α=0.05， P&<0.05 为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　共制作大鼠心脏腹部移植模型73例，成功68例，失败病例有吻合口出血1例，心房出血1例，迟发性出血1例，麻醉过度2例。腹部心脏移植模型中受体大鼠下肢缺血时间(30±4)min。颈部心肺联合移植模型47例，成功38例，失败病例有吻合口出血1例，吻合口狭窄2例，迟发性出血1例，麻醉过度1例，术后感染和停跳各2例。

　　腹部移植模型成功率93.2%，颈部移植模型成功率80.9%。腹部移植模型成功率较高(χ2=4.197， χ20.05，118=3.84，P&<0.05)。

　　两组手术中的供心摘取时间、动脉吻合时间及总体手术时间见表1。其中腹部移植组的供心摘取时间和动脉吻合时间均小于颈部心肺联合移植组(供心摘取时间t检验，t=9.174，动脉吻合时间t检验，t=4.389，t118，0.05=1.653，P&<0.05)。但由于颈部心肺联合移植术只需吻合一根血管，两手术组整体用时差异无统计学意义(总体手术时间t检验，t=1.491， t118，0.05=1.653，P&>0.05)。表1 腹部及颈部心肺联合移植模型各阶段用时

　　3 讨 论

　　3.1 技术要领和体会

　　3.1.1 麻醉 ①供体与受体术前禁食与手术成功与否无对应关系。②麻醉剂量和浓度都要合适，参照文献[3]及本实验使用观察后认为1%戊巴比妥(1 g/100ml)按40 mg/kg给药，药物计量和吸收效果良好。③首次给药剂量应足够，反复给药极易造成大鼠死亡。本组大鼠术中确需加用麻醉药，予首次剂量的1/3皮下注射，术中在大鼠明显挣扎时再给药。

　　3.1.2 供心处理 ①在全身降温的基础上对心脏直接降温可使心脏停搏[4]，避免热缺血，但应在开胸前使大鼠全身充分降温。浸没在含冰块的生理盐水中可保持供心处于柔软的良好停跳状态。②用冰生理盐水冲洗冠脉系统时，灌洗针头不能进入主动脉过深，以免损伤主动脉瓣;灌洗压力应适中。③分离、切断肺动脉时，应细心分离其后方的粘连而不伤及左心房，分离不够会在整体结扎后将肺动脉拉向线结，从而出现肺动脉与下腔静脉缝合困难。④在分离切取供心、缝合的整个过程中，切忌尖锐器械碰触，尤其心房、肺壁极薄，易损伤又不易修补，细微的损伤都会导致开放血管后供心大出血。

　　3.1.3 腹腔吻合法 ①先进行受体手术可缩短供心缺血时间，减少供心心功能缺血性损伤。②大鼠腹部血管背侧有较多的分支，但只需结扎1～2支，左右分支均活结结扎以便手术结束时开放以恢复组织供血。血管阻断区域的头、尾端套线并打单结可方便阻夹或开放血管夹，在下腔静脉穿刺注射抗凝药物后如轻压不能止血，轻提套线可有效止血。③受体大鼠如不予抗凝，在试开放血管吻合如有出血而补针时极易形成血栓，但抗凝过度易致吻合口出血[5]。④因血管切开后失去张力会有一定程度的回缩，选择腹主动脉前外侧切口可保证吻合血管的边距。含血下腔静脉能很好地衬托出腹主动脉的边界，应于动脉缝合完成后进行肺动脉与下腔静脉吻合时才能切开。⑤腹主动脉及下腔静脉阻断时间超过45 min就可能导致双下肢热缺血损伤，术后出现双下肢瘫痪[6]，因此缝合用时不能过长。

　　3.1.4 颈部吻合法 ①受体大鼠应在250 g以上。②分离颈总动脉时勿损伤迷走神经，要保证上阻断血管夹后能有良好的间距供切开和缝合。③颈部皮下游离空间要足够，以保证供体心肺能容入且不被过度挤压。

　　3.1.5 缝合技术 ①在供心、受体血管对位良好时，单纯连续缝合即可达到良好吻合血管的要求。②供心主动脉与受体动脉缝合边距和针距各0.5 cm已可使吻合口处血管边缘结合，无需担心吻合口漏血而将一侧或两侧边距缝合过宽。但动脉切开处两端缝合平整是不渗漏的重要保证。③动脉壁切口应比升主动脉稍小，否则易使吻合口腹主动脉两端张力过大，引起撕裂出血。④缝合过程中提拉缝线应轻柔，过分提拉缝线往往造成吻合口无出血而两侧针眼出血。⑤在缝合完成后试开放动脉近端如有吻合口出血点而需补针时，应注意加缝的缝合宽度为原缝合边距，缝合过宽易导致打结时撕裂出血或狭窄，甚至吻合失败。⑥因大鼠的血容量占其体质量的7.4%，200 g左右的大鼠手术中累计出血1～2 ml即易致休克、麻醉不能苏醒等严重后果[5]，整个手术过程都应注意止血。

　　3.2 两种术式优缺点分析

　　腹腔吻合法的优点：①掌握手术技巧后操作简洁，腹部血管较粗，成功率较高。②腹腔空间大，心脏不受挤压，可长期存活。③因头颈部不受影响，术后捉拿、给药均较方便。缺点：①创面大，术中将肠管全部托出，对大鼠内环境影响很大。②术后观察不太方便。

　　颈部心肺联合法的优点：①对大鼠内环境影响较小。②术后观察较容易。③可在颈部移植的基础上进行腹部再次移植研究。缺点：①对术后大鼠头颈部活动有明显影响。②因颈部部位和血管较细因素，成功率相对较低。

参考文献

　[1] Ono K， Lindsey ES，Orleans N，et al. Improved technique of heart transplantation in rats[J].J Thorac Cardiovas Surg， 1969， 57(2): 225-229.

　　[2] 陈 述，舒新军，徐三荣，等. 大鼠颈部心肺联合移植模型的建立[J].江苏大学学报:医学版， 2008，18(1):27-29.

　　[3] 程晓峰，景 华，王常田，等. 建立大鼠心脏移植模型的麻醉选择[J].医学研究生学报， 2005，18(10):958-959.

　　[4] 邹循锋，鄢业鸿.大鼠异位心脏移植模型的制作[J].江西医学院学报， 2006，46(6):14-16.

　　[5] 金钟大，陈江华.大鼠腹腔心脏移植技术的改良[J].局部手术学杂志， 2004，13(3):162-164.

　　[6] 王晓亮，彭志海.大鼠腹部心脏移植模型的改进[J].实验动物与比较医学，2008，28(3):183-185.