伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能研究

　　　　 作者：李君辉 罗哲 谢新民 李安平， 杜鸿 生秀梅 黄新祥

【摘要】 　　目的： 探讨伤寒沙门菌调节因子UhpA的功能。方法： 用载体pBAD介导回补uhpA至伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株，用qRTPCR观察cysM和treB基因表达，用表达载体pET22b原核表达UhpA蛋白，用凝胶阻滞试验观察UhpA蛋白与cysM和treB启动子区域DNA片段的结合。结果： 成功构建pBADuhpA重组质粒，在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因后，cysM和treB的表达明显恢复，但UhpAHis6蛋白与cysM和treB的启动子区域DNA片段无明显结合。结论: 伤寒沙门菌UhpA在高渗应激条件下能促进硫代谢及海藻糖代谢相关基因表达，且可能为间接作用。

【关键词】 伤寒沙门菌； UhpA； 凝胶阻滞； 基因表达调节

　　［Abstract］ Objective: To explore the function of the regulator UhpA in Salmonella enterica serovar Typhi. Methods： A recombinant plasmid pBADuhpA containing the uhpA gene with its own promoter was transferred into the uhpA deleted mutant of S.entericar serovar Typhi. qRTPCR was performed to observe the expression of cysM and treB. UhpA protein was expressed by a recombinant plasmid pET22buhpA in E.coli. The gel shift assays was performed to explore the combination between UhpA and the promoter region of cysM and treB.Results: Recombinant plasmid pBADuhpA was successfully constructed. After complementing uhpA gene in the uhpA deleted mutant， the expression of cysM and treB was obviously restored. Gel shift assays showed that UhpA protein could not bind the promote region of cysM and treB. Conclusion: At upshift high osmotic treatment， the UhpA may promote the expression of genes involved in the metabolism of sulfur and trehalose indirectly.

　　［Key words］ Salmonella enterica serovar Typhi; UhpA; gel shift assay; gene expression regulation
　　
　　伤寒沙门菌（Salmonella enterica serovar Typhi）是沙门菌属中一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核生物基因表达与信息调控研究的模式菌［1］。沙门氏菌在感染的过程中，必须适应新环境（渗透压、酸性环境、巨噬细胞吞噬、抗菌肽等），对不同环境的调节主要由细菌多种双组分调节系统（twocomponent regulatory system)来介导［2］。目前在沙门氏菌和埃希菌（Escherichia coli）中已发现数十种双组分调节系统。
　　
　　UhpB/UhpA作为一种双组分调节系统，调控转运蛋白UhpT的表达，从而有助于细菌利用外界环境中的6磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源［3］。我们最近的基因芯片相关分析表明，uhpA基因缺陷变异株在高渗应激条件下相对于野生株有一系列基因的表达发生了明显的下调，而且这些基因大多与硫代谢相关。这提示在高渗应激条件，uhpA基因可能参与硫代谢途径的调控［45］。为了深入地研究UhpA的功能，我们在uhpA基因缺陷变异株中回补uhpA基因，通过qRTPCR观察其对下调基因表达的影响，同时表达UhpA蛋白，通过凝胶阻滞试验，分析UhpA对于硫代谢途径的相关基因是直接还是间接调控。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料

　　1.1.1 菌株和质粒　　

　　菌株：伤寒沙门菌野生株GIFU10007，uhpA-（伤寒沙门菌野生株GIFU10007剔除uhpA基因），uhpA-（pBAD）（uhpA-含pBAD/gⅢ 质粒），uhpA-（pBADuhpA）（uhpA-含pBADuhpA）、大肠埃希菌E.coli DH5α，E.coli TG1，E.coli JM109，E.coli JM109（pET22buhpA）（E.coli JM109含pET22buhpA）
　　
　　质粒：pBAD/gIII，pET22b（两质粒用于蛋白表达，Amp抗性），pBADuhpA（pBAD/gⅢ含uhpA基因及其启动子区域），pET22buhpA（pET22b含uhpA基因）

　　1.1.2 主要试剂

　　限制性核酸内切酶BamH Ⅰ，SalⅠ，NcoⅠ，T4 DNA连接酶，ExTaq，pfuTaq，无RNA酶的DNA酶Ⅰ，TA克隆试剂盒均为TaKaRa（大连）公司产品；琼脂糖，胶回收试剂盒均为Promega公司产品；蛋白纯化系统，总RNA提取试剂盒为Qiagen公司产品；反转录试剂盒SuperScriptⅢ（Invitrogen公司）；GSM缓冲液根据相关文献配制［6］。

　　1.1.3 主要仪器

　　PCR扩增仪2700(ABI)；凝胶成像系统Gene Genius Bioimaging System(BioRad)； 电转化仪Gene Pulsero II(BioRad)；核酸检测仪Spectrophotometer ND1000（NanoDrop）；荧光定量PCR仪（Corbett）；垂直平板电泳仪（BioRad）。

　　1.1.4 引物合成

　　本文所用引物均由上海生工生物技术公司合成，引物序列见表1。表1 引物序列（略）

　　1.2 方法

　　1.2.1 uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因　

　　分别在uhpA基因上、下游设计引物Fa与Fb并在5′端加NdeⅠ， XhoⅠ酶切位点，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的基因，将纯化后的PCR产物与载体pBAD/gⅢ同时用NdeⅠ， XhoⅠ双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后用T4 DNA连接酶22℃过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1，筛选疑似阳性克隆并用NdeⅠ， XhoⅠ双酶切和PCR分析鉴定，并经基因序列分析验证（由上海英骏生物技术公司完成）。将构建成功的重组载体pBADuhpA转入uhpA缺陷变异株，将其命名为uhpA回补株uhpA-(pBADuhpA），同时将空pBAD/gⅢ载体导入uhpA缺陷变异株作为对照株uhpA-（pBAD）。

　　1.2.2 细菌培养及总RNA提取

　　挑取S.Typhi GIFU10007，uhpA-（pBADuhpA）和uhpA-（pBAD）单菌落接种于1 ml等渗LB培养液中，37℃振荡（250 r/min）培养过夜，以1∶100分别转接于20 ml等渗LB培养液中，LB培养液中均加入了0.2%的L阿拉伯糖，37℃振荡（250 r/min）培养4 h至对数生长期，再加入终浓度为300 mmol/L的NaCl培养30 min。冰上放置15 min后离心（4 000 r/min，10 min，4℃）收集菌体。用总RNA提取试剂盒提取细菌总RNA，并用无RNA酶的DNA酶Ⅰ（37℃ 20 min，80℃ 15 min）消化残量DNA。用核酸检测仪检测RNA浓度，同时取1 μl进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量。-70℃保存RNA备用。

　　1.2.3 qRTPCR

　　采用上述方法提取和处理细菌总RNA，取4 μg总RNA，用N8随机引物，按照反转录试剂盒操作进行反转录。从筛选的差异表达基因中，选取2个差异基因，用特异性引物进行qRTPCR，观察基因表达。qRTPCR采用SYBR Green并按文献［6］进行，用基因组DNA梯度稀释制作相应的标准曲线，据样品测定的初步结果确定标准品浓度范围。采用基因特异性引物进行扩增，扩增产物长度cysM为265 bp，treB为290 bp，序列信息见表1。

　　1.2.4 UhpA蛋白的表达纯化

　　分别在uhpA基因上、下游引物的5′端加上NdeⅠ和XhoⅠ酶切位点，去除基因本身的终止子，利用载体上His6后面的终止子，使表达的UhpA蛋白C末端带有His6标签。以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用高保真DNA聚合酶pfu扩增目的片段，将纯化后的PCR产物与回补载体pET22b同时用NdeⅠ，XhoⅠ双酶切，酶切产物用酚仿-乙醇法纯化后，用T4 DNA连接酶22℃过夜连接。连接产物用热休克法转化至大肠埃希菌TG1。提取疑似阳性克隆的质粒，用NdeⅠ，XhoⅠ双酶切和PCR分析鉴定，并经DNA序列分析验证（由上海英骏生物技术公司完成）。将构建成的重组质粒转入大肠埃希菌JM109。挑取重组质粒转化株单菌落接种于1 ml等渗LB培养液中，37℃振荡（250 r/min）培养过夜，以1∶100分别转接于20 ml等渗LB培养液中，37℃振荡（250 r/min）培养4 h至对数生长期。加入终浓度为0.01 mmol/L的IPTG，26℃振荡（250 r/min）培养8 h，离心（4 000 r/min，10 min，4℃）收集菌体，加入裂解液并用超声破菌，取上清用镍柱按产品说明纯化UhpA蛋白。

　　1.2.5 凝胶阻滞试验

　　据NCBI公布的伤寒沙门菌Ty2基因组序列信息，设计特异性引物cysD，treB，设计引物位置为转录起始点上游约250 bp，下游约50 bp，总长度约300 bp，以伤寒沙门菌GIFU10007为模板，扩增出cysD基因以及treB基因启动子区域。用酚仿乙醇法纯化PCR产物，取1～2 μg PCR产物与不同浓度的UhpA蛋白混合，加入相应体积的GSM缓冲液，使三者反应总体积为20 μl，30℃孵育15 min。选取198 bp的真核生物PCR产物作为阴性对照，8%的丙烯酰胺胶电泳分离条带，溴化乙啶染色［8］。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 uhpA回补株的构建
　　
　　为进一步研究UhpA功能，本研究在uhpA缺陷变异株中回补uhpA基因，以伤寒沙门菌野生株基因组DNA为模板，用特异引物扩增目的片段，全长841 bp，包括uhpA的启动子，编码区域及终止子。将纯化后的扩增产物与载体pBAD/gⅢ定向连接，构建成pBADuhpA重组质粒。DNA序列分析显示重组区域无碱基突变，表明pBADuhpA重组质粒构建成功。进而将pBADuhpA重组质粒和空质粒pBAD/gⅢ分别导入uhpA缺陷变异株，构建成uhpA回补株和对照株。
　　
　　2.2 qRTPCR分析cysM和treB基因的表达
　　
　　本研究选取半胱氨酸合成酶编码基因cysM和6磷酸海藻糖水解酶编码基因treB作为代表，用qRTPCR观察分析UhpA对硫代谢与海藻糖代谢相关基因表达的调节作用。标准曲线以cysM为例（图1）。结果显示高渗应激30 min后，伤寒沙门菌uhpA缺陷株的cysM和treB的表达明显低于野生株，在回补株中两者的表达水平有明显恢复，而对照株中则无此现象（图2）。
　　
　　2.3 UhpA蛋白表达
　　
　　为了进一步研究UhpA对硫代谢及海藻糖相关基因是直接调控还是间接调控，本文设计凝胶阻滞试验，以分析UhpA能否与cysM和treB的启动子区域DNA片段结合，因此首先需通过原核表达获取UhpA蛋白。将构建成功的重组表达质粒pET22buhpA转入大肠埃希菌JM109，加入终浓度为0.01 mmol/L IPTG，26℃诱导表达UhpA蛋白，经SDS－PAG电泳分析显示（图3），表达的UhpA蛋白部分为可溶性，由于设计表达的蛋白C末端带有组氨酸（His6）标签，因此通过镍柱纯化获得了可溶性UhpA蛋白。

　　2.4 凝胶阻滞试验结果
　　
　　为了观察UhpA能否与硫代谢及海藻糖相关基因的启动子区域DNA片段结合，本研究采用凝胶阻滞试验，将treB启动子区域的PCR产物和cysD启动子区域的PCR产物分别与不同浓度的UhpA蛋白以及作为对照用的适量的来自于真核生物DNA片段，在GSM缓冲液中30℃孵育15 min后进行非变性PAG电泳，结果（图4）发现，UhpA蛋白与treB，cysD启动子区域无明显结合。结果提示，UhpA对treB，cysD等基因的调控可能为间接作用。

　　3 讨论
　　
　　伤寒沙门菌是一种经消化道感染的重要人类致病菌，可造成全身系统性感染。UhpB/UhpA双组分调节系统是沙门菌的一种十分重要的双组分调节系统，调控转运蛋白UhpT的表达，而有助于利用外界环境中的6磷酸葡萄糖作为碳源或能量来源［3］。基因表达谱研究发现伤寒沙门菌在高渗应激15 min后，uhpA与uhpB基因表达有明显上调［7］，推测UhpA在高渗应激条件下或能参与对其他基因的表达调控。
　　
　　我们最近在制备伤寒沙门菌uhpA基因缺陷变异株后，利用伤寒沙门菌基因组芯片分析uhpA基因缺陷变异株与野生株在高渗应激30 min后的转录谱，发现两者之间只有21个基因的表达出现差异，且这些基因在uhpA基因缺陷变异株中相对于野生株全部表现为下调，其中cysJ，cysD，cysP，cysW，cysU，cysA，cysC，cysK，cysH，sopD这10个基因下调最为明显。令人惊奇的是，细菌利用外界环境中的无机硫参与半胱氨酸生物合成途径的基因全部下调，它们是cysJ，cysD，cysP， cysW，cysU，cysA，cysC，cysK，cysH，cysN，cysI，cysM［4］。之前的研究已经报道参与半胱氨酸生物合成途径的基因受LysR类型的转录激活因子CysB和Cb1调控［8-9］。cysB在革兰阴性菌中是一个高度保守的基因，cb1编码的蛋白参与有机硫的转运和脱磺酸基作用。值得注意的是，在伤寒沙门菌中乙酰丝氨酸是CysB与Cb1调节因子不可缺少的诱导物［10-11］。我们的实验显示在高渗应激30 min后，UhpA显现出同CysB与Cb1被乙酰丝氨酸激活后类似的功能。另外，作为已经被证实的受UhpB/UhpA双组分调节系统直接调控的UhpT，在高渗应激30 min后并没有明显的变化，有可能是因为环境中没有6磷酸葡萄糖的刺激。另外，在这21个基因中，也包含了参与海藻糖代谢的treB和treC基因［4］。因此，UhpA很可能在高渗应激条件下通过半胱氨酸生物合成途径参与了硫代谢。
　　
　　为了进一步观察和研究UhpA对氨基酸和糖代谢相关基因的表达调节功能，本研究首先利用重组质粒对uhpA基因缺陷变异株回补uhpA基因，选用参与半胱氨酸生物合成的cysM基因和参与海藻糖代谢的treB基因作为代表，用qRTPCR特异性分析cysM和treB基因表达，结果进一步证实，在高渗应激下伤寒沙门菌UhpA确实可以促进半胱氨酸生物合成和海藻糖代谢相关基因的表达。
　　
　　为了分析UhpA促进基因表达是直接作用还是间接作用，我们利用原核表达并纯化获得UhpA蛋白，选择参与无机硫代谢的cysD基因与参与海藻糖代谢的treB基因的启动子区域，进行凝胶阻滞实验，发现UhpA不能直接结合于两者的启动子区域，结果提示UhpA促进半胱氨酸生物合成和海藻糖代谢相关基因的表达可能为间接作用。UhpA作为UhpB/UhpA双组分调节系统中的反应调节蛋白，通常认为在菌体中当其磷酸化后才能影响靶基因表达，但也有研究报道当双组分调节系统反应调节蛋白的浓度达到一定水平时，即使其不发生磷酸化，也能作用于下游基因［12］。由于本次研究没有进行磷酸化UhpA蛋白相关的试验，所以目前尚不能完全肯定UhpA的这种间接作用。
　　
　　总之，本次研究结果表明，伤寒沙门菌中UhpA在高渗应激条件下对硫代谢及海藻糖代谢相关基因的表达发挥调控作用，且有可能为间接调控。

参考文献

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