作者:苏建华, 林伟, 张俊华 唐金荣 肖杭 包德诚
【摘要】 目的: 探讨甲钴胺对坐骨神经损害后背根神经元保护作用机制。方法: 采用SD大鼠,随机分为正常组、模型组和甲钴胺组,预处理14 d后制作坐骨神经损害动物模型,分别在模型制备后12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d各组提取L1-5背根神经节,免疫组化染色计算Bcl2、Bax阳性细胞表达数。结果: 甲钴胺组于模型制备后12 h Bcl2即有明显表达,24~48 h达高峰,持续至7 d时与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05);甲钴胺组Bax表达与同期模型组比较均有不同程度降低,7 d时表达水平最低,与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05)。结论: 甲钴胺的神经元保护作用与其上调Bcl2蛋白、抑制Bax蛋白的表达有关。
【关键词】 甲钴胺; 神经元; B细胞淋巴瘤/白血病2; Bcl2相关X蛋白; 大鼠
[Abstract] Objective: To study the protective mechanism of methycobal on neuron of dorsal root ganglion with the sciatic nerve lesion model of rats. Methods: SD rats were randomly pided into normal, model, methycobal group. Preconditioned respectively for 14 days, then the sciatic nerve lesion models were performed, the expression of Bcl2 and Bax were detected by immunohistochemical method 12 h, 24 h, 48 h, 72 h, 5 d, and 7 d after the operation,respectively. Results: After 12 h of the model operation, The expressions of Bcl2 in methycobal group increased obvionsly, peaked at 24 h~48 h, and also the expressions of Bcl2 in methycobal group increased obvionsly 7 d, compared with model group (P&<0.05). The expressions of Bax in methycobal group were less than those in model groups from 12 h after the sciatic nerve lesion, and lowest 7 d; it was different significantly than those in model group(P&<0.05). Conclusion: Methycobal might upregulate the expressions of Bcl2 and downregulate the expressions of Bax to perform the neuroprotective effect.
[Key words] methycobal; neuron; Bcell lymphoma/leukemia2; Bcl2 associated X protein; rat
周围神经损伤后可引起相应节段神经元的死亡,严重地影响了周围神经的再生及其功能的恢复,本课题前部分实验已证实了甲钴胺对周围神经损害后神经元有确切的保护作用[1],但其作用机制尚不明确,本实验以甲钴胺预处理后观察动物模型背根神经元Bcl2、Bax的表达,以探讨甲钴胺对坐骨神经损害后神经元保护机制。
1 材料与方法
1.1 材料与分组
甲钴胺由卫材(苏州)制药有限公司提供(批号:020564),免疫组化试剂盒(即用型非生物素pv6001/6002试剂盒)、DAB显色试剂盒、国产分析纯由北京中杉金桥生物技术有限公司提供。常规神经分离设备一套,SD大鼠72只,SPF级,体质量180~220 g(由无锡市江南实验动物有限公司提供)。禁食12 h,按体质量随机分为正常组、模型组和甲钴胺组,每组24只,雌雄各半。
1.2 方 法
1.2.1 预处理 正常组不给药;甲钴胺组按人与动物体表面积折算的等效计量比值表计算法予甲钴胺104 μg·kg-1·d-1,腹腔注射,共14 d;模型组按0.8 ml·kg-1·d-1腹腔注射生理盐水,共14 d,常规饲养。
1.2.2 大鼠周围神经损害动物模型的建立 参照文献[2]方法制作周围神经损害动物模型:大鼠用3%戊巴比妥10 ml/kg麻醉,仰卧固定于鼠板上,于右后肢腹股沟处切开皮肤1 cm,钝性分离肌肉组织,显露坐骨神经,正常组坐骨神经显露后即关闭切口,其余两组大鼠用压力计以0.5 kg/1 000 g的压力挤压坐骨神经,持续30 s,关闭切口。常规注射抗生素预防感染。
1.2.3 背根神经节的分离 分别于模型制备后12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d各组处死实验大鼠4只,参照文献[3]方法,处死大鼠立即切开背部皮肤,沿脊柱两侧剪断与之相连的肋骨,取出胸腰段脊柱,置于氧饱和的DMEM液内,pH7.4,溶液的渗透压为952.01 kPa。然后由脊柱正中剖开椎管从内侧小心分离L1-5背根神经节,置于10%甲醛溶液中,做Bcl2、Bax免疫组织化学染色检查。
1.2.4 神经节Bcl2、Bax免疫组织化学染色 采用二步法免疫组化方法染色,步骤:①载玻片采用3丙氨基三乙氧基硅烷(3aminopropyltriethoxysilane,APES)涂片;②切片常规脱蜡至水;③3% h3O2去离子水孵育5~10 min,阻断内源性过氧化酶;④对抗原进行热修复;⑤滴加一抗(Bcl2、Bax、VEGF鼠抗人单克隆抗体,即用型),4 ℃冰箱过夜,PBS冲洗,2 min×3次;⑥滴加山羊抗小鼠IgG 抗体HRP多聚体,室温孵育20~30 min,PBS冲洗,2 min×3次;⑦DAB显色;⑧自来水冲洗;⑨苏木精复染,脱水透明,封固;⑩显微镜(×400倍)观察,Bcl2、Bax阳性染色均为胞质内出现褐黄色颗粒。
1.2.5 图像分析 各组各时间点随机抽取2个样本作Bcl2、Bax免疫组化染色观察阳性表达细胞数(每张切片任取5个视野计数相应的免疫组化染色阳性表达细胞数,取其平均值)并加以比较。
1.2.6 统计方法 实验结果以±s表示,用SAS6.12统计软件包进行方差分析,两两比较采用q检验,P&<0.05为差异有统计学意义。
2 结 果
2.1 甲钴胺对大鼠坐骨神经损害模型背根神经元Bcl2表达的影响 正常组背根神经元细胞Bcl2有少量表达(图1a);模型组于模型制备后24 h Bcl2表达即有明显增加,与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.05),48 h Bcl2表达达到高峰(图1b),与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.01),7 d时降至正常组水平(图1c);而甲钴胺组于模型制备后12 h Bcl2即有明显表达,与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05),与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.05),24~48 h Bcl2表达达到高峰(图1d),7 d时表达仍较高(图1e),与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05),见表1。表1 甲钴胺对大鼠坐骨神经损害模型背根神经元Bcl2表达的影响与正常组比较;c:P&<0.05,d:P&<0.01,与模型组比较
2.2 甲钴胺对大鼠坐骨神经损害模型背根神经元Bax表达的影响 正常组背根神经元细胞Bax有极少量表达(图2a);模型组于模型制备后12 h Bax即有表达,24 h 表达达高峰(图2b),持续至5 d,与正常组比较差异均有统计学意义(P&<0.01),7 d时模型组Bax仍有极高表达(图2c),与正常组比较差异有统计学意义(P&<0.05);而甲钴胺组于模型制备后12 h仅见少量Bax表达,与模型组比较差异有统计学意义(P&<0.05), 24 h~7 d Bax表达均较同期模型组降低(P&<0.05)(图2d、2e),见表2。表2 甲钴胺对大鼠坐骨神经损害模型背根神经元Bax表达的影响:P&<0.05,b:P&<0.01,与正常组比较;c:P&<0.05,与模型组比较
3 讨 论
目前,对于神经元保护作用的研究多集中于各种神经营养因子如神经生长因子(NGF)、睫状神经营养因子(CNTF)、脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子3、4、5(NF3、NF4/5)、胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)[4-7]以及caspases抑制剂、钙通道阻滞剂、单胺氧化酶抑制剂等。甲钴胺是VitB12的衍生物,是VitB12的甲基化活性制剂,其中心钴分子上有一活性甲基基团,可参与物质转甲基作用,加速核酸和蛋白质的合成,同时进入受损的神经组织,通过在神经损害区加速神经膜细胞的细胞分裂及促进磷脂酰胆碱的合成而促进神经再生、刺激轴突再生[8]。
Bcl2基因是1984年从滤泡性淋巴瘤细胞中分离出来的原癌基因,由239个氨基酸残基组成。Bcl2家族成员包括抑制细胞凋亡的Bcl1、Bcl2、BclXL、BclX和促进凋亡的Bax、Bclxs、Bad、Bik等,两类分子的比例决定细胞是否凋亡。Bcl2的表达可抑制谷氨酸神经毒性、抑制神经元钙超载、从而抑制神经细胞凋亡,起到内源性保护作用[9]。Bax是Bcl2家族成员之一,有对抗Bcl2、促进凋亡的功能[10]。
本实验以甲钴胺预处理14 d达最高稳态血药浓度后,建立坐骨神经损害动物模型,用免疫组化方法动态观察各组不同时间点Bcl2、Bax表达,正常组、模型组Bcl2均有少量表达,表明Bcl2可能存在保护神经细胞在损伤后免于死亡的一种积极生存机制,而甲钴胺组于模型制备后Bcl2表达明显较模型组提前,表达峰值明显升高;且甲钴胺组Bax表达于模型制备后与同期模型组比较均有明显降低,说明甲钴胺的神经元保护作用与其上调Bcl2、抑制Bax的表达有关,推测其保护信号途径可能为抑制细胞色素C的释放,从而减弱caspase3表达过程,但此推测尚需进一步研究证实。
参考文献
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