白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT表达及其启动子的影响

　　　　 作者：王晓燕， 范钰， 张尤历， 钟锡明

【摘要】 目的： 观察白藜芦醇对大肠癌细胞生长增殖的影响，并从人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)表达及其启动子方面探讨可能的抗癌机制。方法： 以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞后，收集细胞，分别采用荧光实时定量RTPCR和蛋白质印迹法检测癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平。采用脂质体转染法将携带hTERT启动子和报告基因的质粒转染至大肠癌LS174T细胞中后，加入不同浓度的白藜芦醇，孵育48 h后，检测报告基因萤虫素酶活性。结果： 白藜芦醇处理大肠癌细胞后，增殖明显受到抑制，且与浓度有关。癌细胞hTERT mRNA和蛋白水平明显下调，且呈浓度和时间依赖性。白藜芦醇处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。结论： hTERT启动子活性和hTERT表达下调，可能是白藜芦醇抑制癌细胞增殖的重要机制之一。

【关键词】 白藜芦醇; 大肠肿瘤; 人端粒酶逆转录酶; 启动子

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of resveratrol on human telomerase reverse transcriptase(hTERT) and its promoter of human colorectal cancer cell. Methods： After LS174T human colorectal cancer cell were treated with different dose of resveratrol，mRNA and protein of hTERT were determined by realtime PCR and Western blot，respectively. The plasmid inserted hTERT promoter was transected into LS174T cells by oligofecamine 2000， and different doses of resveratrol were added into culture media 2 hours later. After 48 hours， luciferase activity of colorectal cancer cell was determined. Results： The expression of mRNA and protein of hTERT of cells treated with resveratrol were downregulated in doseand timedependent manner. The luciferase activity of cancer cells treated with resveratrol were inhibited in dosedependent manner. Conclusion： Resveratrole may suppress telomerase activity through inhibiting expression of hTERT promoter of colorectal cancer cell.

　　[Key words] resveratrole; colorectal carcinoma; human telomerase reverse transcriptase; promoter

　　已有研究发现，85%～90%的肿瘤包括大肠癌中都有端粒酶的活化表达，而正常细胞(生殖细胞除外)及正常组织几乎没有端粒酶活性，正常细胞向肿瘤细胞转变过程中大多伴随端粒酶的激活[1]。端粒酶的活化可能是恶性肿瘤发生的关键环节之一[2]。目前研究证实，端粒酶蛋白质组分是其活性调控的主要成分，其中催化亚单位之一人端粒酶逆转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT) 的激活与端粒酶的激活密切相关，二者呈正相关[3-5]。

　　大肠癌是最常见的恶性肿瘤之一，近年来发病率逐渐增高。研究发现，端粒酶的激活在大肠黏膜癌变发生发展中起着重要的作用[3，4]。由正常大肠黏膜发展到大肠癌，端粒酶阳性表达率呈递增趋势[5]。因此，采用各种方法及从各种途径抑制端粒酶活性，将有助于大肠癌的综合治疗。

　　白藜芦醇(resveratrol)是从葡萄、水果和蓼科植物根部提取出来的有效成分，研究发现，该药具有抗氧化、抗炎的作用，而且对许多癌细胞生长具有一定的抑制作用。最近国内外学者研究表明，白藜芦醇的抗癌作用与抑制端粒酶活性有关[6-8]，但内在机制尚不清楚。为此，本研究采用白藜芦醇处理大肠癌细胞，观察其对癌细胞hTERT表达及其启动子的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　白藜芦醇，购自Alexis Biochemicals公司;大肠癌LS174T细胞株，人大肠癌LS174T细胞，购自中科院上海细胞库;胎牛血清购自High Clone;hTERT单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司;hTERT启动子质粒TERT/Luc，含hTERT启动子序列，连接萤虫素酶报告基因，由美国Darmouth大学博士后李华构建，并经测序无误。荧虫素酶试剂盒和SV40质粒(连接报告基因)购自Promega公司;脂质体oligofecamine购自美国Invitrogen公司;hTERT定量PCR引物：上游5′CGTACAGGTTTCACGCATGTG3′，下游5′ATGACGCGCAGGAAAAATGT3′;FAM标记探针：5′FAMAGCTCCCATTTCATCAGCAAGTTTGGAATMARA3′。

　　1.2 白藜芦醇对大肠癌细胞增殖的影响

　　参照文献[9]进行，方法简略如下：以不同浓度(12.5，25，50，100，200，400 μmol/L)的白藜芦醇处理大肠癌细胞不同时间(24，48，72 h)后，每孔加入5 mg/ml的MTT 20 μl，继续培养4 h，去上清。每孔加入二甲基亚砜0.1 ml，摇床向上摇动约15 min，用酶标仪在波长570 nm处计数各孔光密度值(D值)。每组设3复孔。

　　细胞生长抑制率(inhibition ratio，IR)=

　　1-转染组试验孔D值空白对照孔D值×100%

　　1.3 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT mRNA水平的影响

　　1.3.1 RNA提取、逆转录cDNA合成 根据说明书提取细胞总RNA和合成cDNA。

　　1.3.2 荧光实时定量PCR 根据文献[10]进行。50 μl反应体系：hTERT基因上、下游引物各1.5 μl，FAM 1 μl，GAPDH探针2.5 μl，2×PCR Mix 缓冲液 26 μl，cDNA 10 μl，h3O 7.5 μl。然后再进行检测，循环反应条件为：50℃，2 min，1个循环;95℃，10 min，1个循环;95℃， 15 s，60℃，1 min。40个循环。

　　1.3.3 荧光实时定量PCR结果分析 测试样本一式3份，进行多次重复。hTERT基因表达的mRNA，以内参照GAPDH基因的表达按照如下公式进行相对定量：cDNAhTERT=cDNAGAPDH×2ΔCT(ΔCT =CTGAPDH-CThTERT)[cDNAhTERT和cDNAGAPDH分别表示hTERT和GAPDH的cDNA量，CTGAPDH及CT hTERT表示cDNA经PCR扩增到一定量时的循环数]。

　　1.4 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT蛋白水平的影响

　　采用蛋白质印迹法检测。收集细胞，用预冷的磷酸盐缓冲液洗2次，加入细胞裂解液，在冰面上静置10～20 min，用细胞刮匀浆后，4℃，离心10 min，转速15 000 r/min，取上清，加入1/3体积的4×上样缓冲液，煮沸10 min使蛋白变性。样品蛋白经凝胶电泳分离、电转移至硝酸纤维素膜，室温封闭1 h后加入hTERT 单克隆抗体(1∶500)，4℃孵育过夜。漂洗后加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG(1∶500)，37℃孵育1 h，漂洗后用ECL显色，曝光，冲洗胶片。

　　1.5 大肠癌细胞hTERT启动子活性测定

　　1.5.1 质粒转染 大肠癌LS174T细胞以5×105/孔接种于6孔培养板，24 h后根据脂质体说明书进行转染。将待转染质粒以脂质体DNA复合物的形式(比例为1∶10)加入上述细胞培养孔中，同时转染内对照SV40质粒。3复孔，重复3次。

　　1.5.2 萤虫素酶活性测定 质粒转染2 h后加入不同浓度的白藜芦醇， 24 h后更换含10 % 胎牛血清的新鲜培养液及相应浓度的白藜芦醇，于37℃细胞培养箱继续培养24 h后，用预冷的PBS洗3遍，消化收集细胞，加入1×PLB裂解液处理细胞后，用荧虫素酶试剂盒及萤虫素酶测定仪测定萤虫素酶活性。

　　1.6 统计学处理

　　所得数据用±s表示，采用SPPS10.0软件进行处理，组间比较用配对t检验分析。P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 白藜芦醇对大肠癌细胞增殖的影响

　　以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞不同时间后，采用MTT法检测癌细胞生长情况。结果表明，浓度为12.5 μmol/L的白藜芦醇即可对大肠癌LS174T细胞增殖具有抑制作用;随着浓度的增加，抑制作用明显增强;达到400 μmol/L时，增殖抑制作用无明显增加。见图1。

　　2.2 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT mRNA水平的影响

　　以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌LS174T细胞后，收获细胞，采用实时定量RTPCR检测hTERT mRNA水平。结果发现，白藜芦醇处理组细胞hTERT mRNA水平被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性(P&<0.001)。

　　2.3 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT蛋白水平的影响

　　以不同浓度的白藜芦醇处理大肠癌细胞24，48，72 h后，通过蛋白质印迹法检测发现，处理组hTERT蛋白水平明显降低。见图3。

　　2.4 白藜芦醇对大肠癌细胞hTERT启动子表达的调控作用

　　为进一步了解白藜芦醇的抗癌作用是否与抑制hTERT表达有关，将hTERT启动子质粒TERT/Luc转染入大肠癌细胞中，2 h后加入不同浓度的白藜芦醇，48 h后测定hTERT启动子的表达情况。结果表明，与对照组比较，处理组hTERT启动子活性明显受到抑制，且呈浓度依赖性(P&<0.001)。见图4。

　　3 讨 论

　　大肠癌在我国的发病率很高，寻找理想的药物是当务之急。许多学者研究发现，白藜芦醇对多种肿瘤细胞生长具有明显的抑制作用，其机制可能与端粒酶活性改变有关[6-8]。本研究在前期工作基础上，以白藜芦醇处理大肠癌细胞，观察了对hTERT表达及其启动子活性的影响。

　　端粒酶活化是大多数肿瘤发生的关键环节及细胞恶化的必经之路，因而端粒酶不但成为当今新的肿瘤标志物，而且已成为肿瘤基因治疗中一个新的理想靶点。所以，探讨其调控的相关机制，将有助于大肠癌等恶性肿瘤的基因治疗。研究发现，端粒酶催化亚单位hTERT具有限速作用，对端粒酶的活性调节最为重要。hTERT转录水平上的调控是端粒酶基因调控的主要途径[3-5]。

　　本研究将大肠癌细胞用不同浓度的白藜芦醇处理后，分别采用实时定量PCR和免疫荧光标记方法检测大肠癌细胞中hTERT mRNA和蛋白水平，结果发现，大肠癌细胞hTERT mRNA和蛋白被有效地抑制，且呈浓度和时间依赖性。提示白藜芦醇对大肠癌细胞端粒酶活性的抑制作用，与抑制hTERT激活有重要的关系。

　　为进一步了解白藜芦醇抑制端粒酶活性的机制，本研究通过萤虫素酶报告基因的方法探讨了该药对大肠癌细胞hTERT转录水平的影响。本课题组通过脂质体转染法，将hTERT启动子质粒转染至大肠癌细胞株中后，加入不同浓度的白藜芦醇，检测萤虫素酶活性。结果发现，处理组萤虫素酶活性下降，且呈浓度依赖性。由此提示，白藜芦醇抑制大肠癌细胞端粒酶活性机制之一为下调hTERT启动子表达。

　　总之，本研究说明，下调大肠癌细胞hTERT 启动子活性，从而抑制hTERT表达，是白藜芦醇抑制大肠癌细胞增殖和端粒酶活性的重要途径之一。

参考文献

　[1] Boukamp P， Popp S， Krunic D. Telomeredependent chromosomal instability[J]. J Investig Dermatol Symp Proc，2005，10(2):89-94.

　　[2] Raynaud CM， Sabatier L， Philipot O，et al. Telomere length， telomeric proteins and genomic instability during the multistep carcinogenic process[J]. Crit Rev Oncol Hematol，2008 ，66(2):99-117.

　　[3] Cairney CJ， Keith WN. Telomerase redefined: integrated regulation of hTR and hTERT for telomere maintenance and telomerase activity[J]. Biochimie，2008，90(1):13-23.

　　[4] Kyo S， Takakura M， Fujiwara T，et al. Understanding and exploiting hTERT promoter regulation for diagnosis and treatment of human cancers[J]. Cancer Sci，2008，99(8):1528-1538.

　　[5] Fujiwara T， Tanaka N. Telomerasespecific oncolytic virotherapy for human cancer with the hTERT promoter[J]. Uirusu，2008，58(1):11-18.

　　[6] Pearce VP， Sherrell J， Lou Z， et al. Immortalization of epithelial progenitor cells mediated by resveratrol[J]. Oncogene，2008，27(17):2365-2374.

　　[7] Fuggetta MP， Lanzilli G， Tricarico M， et al. Effect of resveratrol on proliferation and telomerase activity of human colon cancer cells in vitro[J]. J Exp Clin Cancer Res，2006，25(2):189-193.

　　[8] Lanzilli G， Fuggetta MP， Tricarico M，et al. Resveratrol downregulates the growth and telomerase activity of breast cancer cells in vitro[J]. Int J Oncol，2006，28(3):641-648.

　　[9] 范 钰，程兆明，张尤历，等. 多西他赛抑制胃癌MKN45细胞增殖的研究[J].江苏大学学报：医学版，2008，17(4)：332-334.

　　[10] 范 钰，郑 树，丁佳逸. 脂质体介导的cripto反义寡核苷酸抑制结肠癌细胞端粒酶活性[J].中国病理生理杂志，2006，22(4)：761-765.