Hfq对伤寒沙门菌高渗应激早期基因表达的调节

　　　　 作者：谢新民 李安平 杜鸿 茅凌翔 罗哲 王敏 黄新祥

【摘要】 目的： 探查伤寒沙门菌hfq基因在高渗应激早期对其他基因表达的影响。方法： 用自杀质粒介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株;利用伤寒沙门菌全基因组芯片技术，比较伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期的基因表达谱差异，并选择部分表达差异基因进行实时定量PCR验证。结果： 伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株制备成功;基因表达谱比较分析结果表明伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株在高渗应激早期有62个基因表达上调，有32个基因表达下调。实时定量PCR结果与芯片分析一致。结论： Hfq作为一个调节因子在伤寒沙门菌高渗应激早期对基因表达起重要调节作用。

【关键词】 伤寒沙门菌; hfq; 高渗应激; 基因芯片分析

　　[Abstract] Objective: To explore the influence of Hfq on gene expression regulation of S.enterica serovar Typhi at earlystage of hyperosmotic stress.Methods： The hfq deleted mutant of S.enterica serovar Typhi was prepared by homologous recombination mediated by suicide plasmid; the difference of gene expression profiles between the wild strain and the hfq mutant at earlystage of hyperosmotic stress was investigated by genomic assay; qRTPCR was performed to validate the results of microarray assay. Results： The hfq deleted mutant of S.enterica serovar Typhi was constructed successfully; gene expression profiles analysis revealed that expression of 62 genes and 32 genes were induced and decreased respectively in the hfq mutant at earlier stage of hyperosmotic stress.The results of qRTPCR were consistent with the results of genomic assay. Conclusion： Hfq of S.enterica serovar Typhi can serve as an important factor to regulate gene expression in response to hyperosmotic stress.

　　[Key words] Salmonella enterica serovar Typhi; hfq; hyperosmotic stress; gene microarray

　　伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhi，S.Typhi)是一种人类严重的肠道致病菌，已成为一种重要的原核基因表达与调控研究的模式生物。hfq基因编码的蛋白是一种分子伴侣，最早是作为大肠埃希菌RNA噬菌体Qβ复制所必需的看家因子而被发现的[1]，它能够帮助小RNA(small RNAs，sRNA)与目标RNA分子结合，通过增加sRNA的稳定性，作为RNA分子伴侣在细菌的基因转录后水平调节目的基因的表达[2]。Hfq除了能稳定sRNA的结构，影响mRNA的翻译外，还能够与RNA酶E(RNaseE)形成降解复合体，同时降解sRNA和mRNA，从而抑制目的基因的表达[3]。

　　目前研究表明，在鼠伤寒沙门菌(Salmonella enterica serovar Typhimurium， S.Typhimurium)中hfq基因与细菌的毒力有密切关系，hfq基因缺陷变异株的侵袭力明显下降，动力也几乎丧失[4]。伤寒沙门菌与鼠伤寒沙门菌同源性较高，而在伤寒沙门菌中，细菌在高渗应激条件下有许多与侵袭相关的基因上调[5]，提示在高渗应激下伤寒沙门菌的基因表达调节机制十分复杂。伤寒沙门菌Hfq是一个非特异的RNA分子伴侣，在高渗应激下能否作为一个调节因子参与基因表达调节值得关注。本研究拟利用伤寒沙门菌基因组芯片进行表达谱分析，分析hfq基因在高渗应激条件下对基因表达调控的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 材 料

　　1.1.1 菌株和质粒 野生型S.Typhi GIFU10007，E.coli SY372λpir和自杀质粒pGMB151由日本岐阜大学医学院微生物学教研室馈赠;E.coli DH5α由本室保存。

　　1.1.2 主要试剂与材料 限制性内切酶BamHⅠ，SalⅠ，T4 DNA连接酶、碱性磷酸酶、ExTaq及rTaq DNA聚合酶、TA克隆试剂盒均为TaKaRa(大连)公司产品;胶回收试剂盒为Promega公司产品;荧光染料Cy3/Cy5dCTP为Amersham Pharmacia Biotech公司产品;总RNA提取试剂盒RNeasy Mini Kit为Qiagen公司产品;反转录试剂盒Super Script Ⅲ FirstStrand为Invitrogen公司产品;cDNA纯化试剂盒QIAquick PCR Purification Kit为Qiagen公司产品;沙门菌基因组DNA芯片由本室制备。

　　1.1.3 主要仪器 凝胶成像系统Gene Genius Bioimaging System(Syngene);PCR扩增仪ABI Applied Biosystem 2720 Thermal Cycler(ABI);电转化仪Gene Pulsero Ⅱ(BioRad);核酸检测仪ND100(NanoDrop);基因芯片扫描分析系统Genepix personal 4100A(Axon Instruments);荧光定量PCR仪Corbett Research RG6000(Corbett)。

　　1.2 方 法

　　1.2.1 PCR引物设计 据NCBI公布的S.Typhi Ty2的基因组序列信息，利用Oligo6软件，在hfq基因上游和下游设计两对特异性PCR引物P1A/P1B和P2A/P2B，以S.Typhi GIFU10007为模板，扩增出488 bp和335 bp的同源性片断(分别用F1，F2表示)。在P1B，P2A的5′端加SalⅠ酶切位点用以定向连接F1和F2片段，在P1A，P2B的5′端加BamHⅠ酶切位点用以克隆F1和F2连接片段至自杀质粒。引物ybeF，dps，tviA，t1642分别根据S.Typhi Ty2基因组中的ybeF，dps，tviA，t1642基因序列信息，在序列中间设计一段特异性引物，通过PCR扩增的量的多少来观察该基因的表达情况。所用引物均由上海生工生物技术公司合成，序列见表1。表1 引物序列

　　1.2.2 制备伤寒沙门菌hfq缺陷株 S.Typhi hfq基因缺陷变异株制备的基本策略同

参考文献

[6]。用酚仿乙醇法纯化扩增出的hfq基因同源性F1，F2片段，用SalⅠ消化F1，F2片段后，用T4 DNA连接酶进行定向连接成F1F2片断，胶回收F1F2片断后与pMD18T 载体连接，转化至E.coli DH5α，筛选阳性克隆，用BamHⅠ酶切和PCR作初步鉴定，并进行DNA序列分析予以进一步的验证(测序由上海生工生物技术公司完成)，然后用碱裂解法提取阳性克隆质粒，用BamHⅠ酶切阳性重组pMD18T质粒，胶回收酶切片段(F1F2)，将其克隆至自杀质粒pGMB151的BamHⅠ酶切位点，用热休克法转入E.coli SY372λpir，筛选阳性克隆，并用BamHⅠ酶切和PCR分析鉴定，提取阳性克隆的自杀质粒后用电击法导入伤寒沙门菌野生株，用引物P1A，P2B扩增同源性片段观察重组现象，将连续4次传代完全重组的菌株作为S.Typhi hfq基因缺陷变异株。

　　1.2.3 细菌培养及总RNA提取 挑取S.Typhi野生株和hfq缺陷变异株单克隆分别接种于1 ml低渗(50 mmol/L NaCl)LB培养液中，37℃振荡(250 r/min)培养过夜，然后以1∶100分别转接于20 ml低渗LB培养液中，37℃振荡(250 r/min)培养3 h至对数生长期，再转入高渗LB培养液中(300 mmol/L NaCl)培养以模拟环境高渗应激。高渗应激30 min后，将培养管置冰水混合液中快速冷却，10 min后离心(4 000 r/min， 10 min， 4℃)收集菌体。用总RNA提取试剂盒分别提取两者总RNA，并用无RNA酶的DNase I消化(37℃ 15 min，80℃ 15 min)残余DNA，用核酸检测仪检测RNA，确定其浓度，同时进行琼脂糖凝胶电泳，分析RNA的质量，对质和量均满足要求(电泳rRNA条带清晰且无残余DNA，总量大于50 μg)的RNA样品进行后续的芯片分析。

　　1.2.4 RNA反转录及芯片分析 S.Typhi hfq基因缺陷变异株制备的基本策略同

参考文献

[7]。分别取20 μg S.Typhi野生株和hfq基因缺陷变异株的RNA，用随机引物(N8)和基因组特异性引物GDP及反转录酶SuperScript Ⅲ进行反转录，同时掺入Cy3/Cy5dCTP标记cDNA。S.Typhi野生株和hfq基因缺陷变异株的RNA进行反转录，并对cDNA进行配对互标Cy3和Cy5，以消除标记差异，纯化cDNA产物后与伤寒沙门菌基因组芯片进行杂交(42℃，16 h)。杂交后用生物芯片扫描仪双通道扫描芯片，采用GenePix Pro6.0软件进行图片处理和数据分析，采用荧光总值对数据进行标准化处理。

　　1.2.5 实时定量PCR(qRTPCR) 按照上述方法提取总RNA，然后反转录成cDNA。反转录体系和条件：4 μg 总RNA，4 μl N8随机引物，1 μl dNTP与4 μl水混合后放65℃温育5 min，再放冰上冷却1 min后加入5×Fs 缓冲液 4 μl，0.1 mol/L DTT 1 μl，RNase OUT 1 μl，SuperScript Ⅲ 1 μl。将反应体系放PCR仪器上反应，反应条件：25℃ 10 min，50℃ 50 min，70℃ 15 min。然后从筛选的差异表达基因中，选取dps， tviA， t1642和ybeF几个基因的引物进行qRTPCR 验证(引物序列见表1)。qRTPCR的体系：10×PCR 缓冲液 2 μl，dNTP 1.6 μl，SYBR Green 1 μl，上下游引物各1 μl，反转录产物1 μl，rTaqDNA聚合酶0.1 μl。反应条件：94℃ 5 min，94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 10 min，反应35个循环。得到的qRTPCR结果用t检验进行统计分析。

　　2 结 果

　　2.1 伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株的制备

　　以S.Typhi 野生株GIFU10007的基因组DNA 为模板，用特异性引物P1A/P1B和P2A/P2B进行PCR扩增，获得了hfq基因上、下游同源性核苷酸片段F1和F2，F1和F2片段定向连接后进行TA克隆。用碱裂解法提取初筛TA克隆阳性质粒，用BamHⅠ酶切和PCR分析鉴定后，将F1F2片断克隆至自杀质粒pGMB151的BamHⅠ位点，连接后转化入E.coli SY372λpir筛选阳性克隆质粒，获得重组F1F2片断的自杀质粒。将阳性重组自杀质粒电击转入S.Typhi 野生株GIFU10007，然后在蔗糖平板上进行重组，得到仅有小片段的菌株后，在LB平板上连续传代4次均只有小片段出现(图1)。说明S.Typhi hfq基因缺陷变异株制备成功， 并经hfq基因序列分析验证。

　　M1: DL2000 DNA 标准参照物; M2:λHind Ⅲ digest DNA 标准参照物; 19分别代表泳道编号;a：伤寒沙门菌hfq基因上下游片段PCR产物;b：重组自杀质粒鉴定;c：重组菌第4次传代后PCR观察结果

　　2.2 高渗应激早期野生株和hfq缺陷株基因表达谱差异

　　将S.Typhi 野生株GIFU10007和hfq基因缺陷变异株在低渗环境下培养后，再转入高渗环境下培养，实现体外模拟高渗应激，在应激30 min后，提取细菌总RNA，利用基因组芯片进行基因组表达谱分析，采用两张芯片平行配对荧光素Cy3/Cy5互标cDNA后杂交，各菌株每个基因可获得4个荧光信号值，采用全局归一法对双色荧光数据进行标准化处理，并计算每个点杂交后不同荧光物质标记所得信号比值，以log(2) Ratio值描述结果，取1和1(表达1倍差异)作为阈值，判断基因上调与下调。结果显示在高渗应激早期(30 min) S.Typhi hfq基因缺陷变异株有62个基因表达上调(其中未知功能基因22个)，32个基因表达下调(其中未知功能基因14个)。

　　2.3 qRTPCR基因表达差异验证

　　为验证基因芯片结果，选取了4个差异表达基因进行qRTPCR验证，结果显示dps基因下调约2倍(P&<0.05)，ybeF基因下调约3倍(P&<0.05)，t1642下调约10倍(P&<0.01)，tviA上调约3倍(P&<0.05)。与芯片分析获得的表达差异情况基本一致，表明芯片分析结果可靠(图2)。

　　3 讨 论

　　伤寒沙门菌是一种经消化道感染的重要人类致病菌， 从肠上皮细胞侵入人体，能抵抗宿主的防御反应，引起严重的全身系统性感染[8]。hfq基因编码的蛋白是一个重要的分子伴侣，能够参与sRNA与靶mRNA的配对，调节基因的表达。Hfq是一个高度保守的RNA结合蛋白， 被认为是细菌基因转录后的关键调控因子，Hfq结构与真核细胞RNA剪切体中的Sm和Sm样蛋白同源。同Sm和Sm样蛋白相似， Hfq通过形成同源六聚体与单链RNA中富含A、U的序列结合， 增加小RNA的稳定性。同样Hfq蛋白也可与sRNA的靶mRNA结合， 从而促进sRNA和mRNA的配对[9，10]。

　　伤寒沙门菌在侵袭宿主的时候会遇到各种应激，其中就包括小肠中的渗透压应激，食物和小肠中的NaCl浓度分别为50，300 mmol/L。我们通过体外模拟高渗应激，利用本室建立的伤寒沙门菌全基因组DNA芯片技术，在高渗应激早期对伤寒沙门菌野生株和hfq基因缺陷变异株的基因表达谱进行分析。结果显示，在高渗应激早期伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株有62个基因的表达上调，32个表达下调。用qRTPCR对表达差异的基因进行验证，结果与芯片结果吻合，说明此次芯片结果可信。gcvT，trmA，yibK等基因是跟甲基转移酶相关的基因，对蛋白质的修饰起一定的作用，芯片结果显示hfq对这些基因有调节作用，说明可能hfq跟蛋白质的加工修饰有关。另外，sdhA， sdhB， sucC，sucD等是编码琥珀酸脱氢酶亚基的一些基因，芯片结果显示hfq能调节这些基因的表达，提示hfq在高渗应激中对细菌的能量代谢可能起着重要的作用。

　　在伤寒沙门菌中，OmpREnvZ双组分调节系统是一个比较重要的与渗透压调节有关的系统。EnvZ编码一种作为渗透压感受器的受体蛋白，其通过磷酸化和去磷酸化调节OmpR的活性，然后OmpR对ompC和ompF进行调节。研究表明外膜蛋白OmpC和OmpF是一种膜孔蛋白，在细菌外膜上形成一种特殊蛋白质通道，通过改变孔径的大小来改变细菌外膜的通透性，他们主要受环境渗透压和OmpREnvZ系统调控。MicC和MicF分别是能调节ompC和ompF的sRNA，他们能够与ompC和ompF的mRNA形成碱基配对，在Hfq蛋白的介导下对其靶mRNA进行负性调节[11-13]。芯片结果显示，在伤寒沙门菌hfq基因缺陷变异株中ompC和ompF上调，hfq基因的缺失影响了MicC和MicF对ompC和ompF的调节，说明hfq能够影响伤寒沙门菌的外膜蛋白表达。另外，在芯片分析结果中我们还看到伤寒沙门菌hfq基因缺陷株中编码渗透调节蛋白的基因omsB和omsC的表达下调，而他们的表达受到Rcs系统的激活[14]。因此伤寒沙门菌在高渗应激条件下hfq与OmpREnvZ系统和Rcs系统可能存在着某些交叉调节，这些有待进一步的研究。

　　另外，在芯片结果中发现荚膜合成的相关基因在hfq基因缺陷变异株中表达上调，提示可能hfq还参与调节荚膜的合成，具体的调节机制还有待进一步的深入研究。

　　本研究对伤寒沙门菌在高渗应激条件下hfq对基因的调节进行探查，结果显示对多个基因的表达有影响，表明hfq基因在伤寒沙门菌高渗应激条件下的基因表达变化调节中有重要作用。

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