缬沙坦对多柔比星诱导的心肌病大鼠心肌线粒体的影响

　　　　作者：徐莉 张赢予 汪健飞 王好 张国辉 苏兆亮

【摘要】 目的： 探讨缬沙坦对多柔比星诱导的心肌病大鼠心肌线粒体结构和功能的影响。方法： SD大鼠完全随机分为3组：模型组(M组，n=15)，缬沙坦干预组(V组，n=15)和对照组(C组，n=10)。M组及V组给予多柔比星(2 mg·kg-1，每周1次)腹腔注射。V组给予缬沙坦(30 mg·kg-1·d-1)灌胃。8周后，超声心动图观察各组大鼠心脏结构及功能的改变，电镜下观察各组大鼠心肌线粒体超微结构，测定各组大鼠心肌线粒体肿胀度、膜电位(ΔΨm)及心肌组织活性氧(ROS)的生成。结果： ①与C组比较，M组大鼠心腔显著增大(P&<0.05)，心功能显著下降(P&<0.05);V组大鼠心功能较M组明显改善(P&<0.05);②与C组比较，电镜下M组大鼠心肌线粒体明显肿胀、嵴断裂、空泡化，钙离子诱导的心肌线粒体肿胀度下降，膜电位显著下降(P&<0.05)，ROS生成增多;V组大鼠心肌线粒体超微结构及肿胀度较M组改善，而膜电位水平也较M组明显提高(P&<0.05)，ROS生成减少。结论： 缬沙坦能改善多柔比星诱导的心肌病大鼠心脏结构及功能，其对心肌线粒体结构和功能的影响，可能是其保护心肌的作用机制之一。

【关键词】 多柔比星; 缬沙坦; 线粒体; 活性氧

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of valsartan on mitochondrial structure and function of adriamycininduced cardiomyopathy in rats′ hearts.Methods： SD rats were pided randomly into 3 groups as follows: adriamycin group(the group M， n=15)， valsartan group(the group V， n=15) and control group(the group C， n=10). The group M and the group V were injected adriamycin intraperitoneal at a dose of 2 mg·kg-1 once a week. Valsartan was administered by gavage at a dose of 30 mg·kg-1·d-1 in the group V. After 8 weeks， the structure and function of hearts in different groups were measured by echocardiography. The ultrastructure of cardiac mitochondria in different groups was detected by electron microscope. The swelling mitochondria induced by Ca2+ and its membrane electrical potential(ΔΨm) were evaluated. The Reactive Oxygen Species(ROS) in different groups was detected. Results： ① Compared with the group C， the chambers of hearts were significantly increased(P&<0.05)， and the function of hearts was significantly decreased(P&<0.05) in the group M. Compared with the group M， the function of hearts was significantly improved in the group V(P&<0.05).② Compared with the group C， cardiac mitochondria′s volume was swelling obviously， their cristae were disrupted， and many of them were vacuolization in the group M， also， Cardiac mitochondria′s swelling induced by Ca2+ was not obvious， ΔΨm was significantly decreased(P&<0.05) and the generation of ROS was increased in the group M. Compared with the group M， the ultrastructure and the swelling induced by Ca2+ of cardiac mitochondria were improved in the group V， also， ΔΨm of cardiac mitochondria was significantly increased(P&<0.05) and the generation of ROS was decreased in the group V. Conclusion： Valsartan can improve the structure and function of rat hearts impaired by adriamycin， and its influence on the structure and function of cardiac mitochondria maybe one of the mechanisms of its protective effect.

　　[Key words] adriamycin; valsartan; mitochondria; reactive oxygen species

　　多柔比星是一种广谱抗肿瘤药，因有明显的心脏毒副作用，在临床应用上受到一定的限制。文献报道[1-2]，多柔比星心脏毒副作用与多柔比星致心肌线粒体功能异常密切相关。缬沙坦是新型的选择性血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1)拮抗剂，在治疗高血压、心衰以及心肌梗死等方面都有较好的疗效，而对多柔比星损伤的心肌线粒体的影响尚未见系统的研究。本实验观察缬沙坦对多柔比星损伤的心肌线粒体结构及功能的影响，并探讨其可能的心脏保护机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物

　　健康雄性SD大鼠40只，8周龄，体质量(250±30) g，由江苏大学实验动物中心提供。

　　1.2 实验仪器及试剂

　　Agilent Sonos5500心脏彩超仪(美国惠普公司)，S12型高频超声探头(Aglilent公司)，透射电镜JEM1010(日本JEOL公司)，ApectraMax 190型酶标仪(美国Molecular Devices公司)，X22R型冷冻离心机(美国Beckman公司)，RF5301PC型荧光分光光度计(日本岛津公司)，荧光倒置显微镜(德国Leica公司)，多柔比星(浙江海正药业有限公司)，缬沙坦(北京诺华制药有限公司)，组织氧化应激活性氧(ROS)试剂盒(上海杰美基因医药科技有限公司)，罗丹明(Rh123)(Sigma公司)，甘露醇、蔗糖、琥珀酸、Hepes、EDTA等均为分析纯。

　　1.3 实验分组及给药方法

　　健康雄性SD大鼠40只，完全随机分为3组：模型组(M组，n=15)，缬沙坦干预组(V组，n=15)和对照组(C组，n=10)。M组及V组给予多柔比星(2 mg·kg-1，每周1次)腹腔内注射，C组给予相同体积生理盐水腹腔注射。V组给予缬沙坦(30 mg·kg-1·d-1)灌胃，M组及C组给予同体积生理盐水灌胃。

　　1.4 超声心动图检测

　　给药8周后即行超声心动图检测，氯胺酮腹腔注射(100 mg·kg-1)全身麻醉，脱前胸部皮毛，S12型高频超声探头(15 MHz)于左室长轴乳头肌水平行心脏形态和功能检测。所有指标均在3个连续的心动周期中由2名观察者分别观测取平均值，计算左室舒张末内径(LVEDD)、左室收缩末内径(LVEDS)，左室射血分数(LVEF)及左室短轴缩短率(LVFS)。

　　1.5 心肌线粒体超微结构观察

　　超声检测结束后处死大鼠，迅速取心尖部心肌组织，采用4%戊二醛和1%四氧化锇双重固定，丙酮梯度脱水，Epon812包埋，铅铀双重染色，透射电镜观察各组大鼠心肌线粒体超微结构。

　　1.6 心肌线粒体的制备

　　取一部分新鲜心肌组织，生理盐水洗净，在预冷的分离液(225 mmol·L-1甘露醇，75 mmol·L-1蔗糖，0.5 mmol·L-1EDTA，10 mmol·L-1TrisHCl，pH7.4)中剪碎，冰浴匀浆，600 ×g，4℃离心5 min，取上清液，8 800×g，4℃离心10 min，弃上清液，沉淀用4℃分离液洗2次，所得沉淀即为线粒体，考马斯亮蓝测定线粒体蛋白浓度。

　　1.7 线粒体肿胀度的测定

　　制备的各组心脏线粒体按1.0 mg·ml-1重悬于线粒体缓冲液(125 mmol·L-1蔗糖，50 mmol·L-1KCl，2 mmol·L-1Kh3PO4，5 mmol·L-1琥珀酸，10 mmol·L-1Hepes，pH 7.4)中，线粒体悬液加入酶标板内，混合200 μmol·L-1Ca2+后，检测波长540 nm处0～10 min光密度差值(ΔD)，ΔD越大，表明线粒体肿胀度越高。

　　1.8 线粒体膜电位的测定

　　各组大鼠线粒体按1.0 mg·ml-1重悬于膜电位缓冲液(225 mmol·L-1甘露醇，70 mmol· L-1蔗糖，5 mmol·L-1Hepes，pH7.2)中，在4℃条件下分别与0.3 μmol·L-1Rh123共孵20 min后，用缓冲液洗2次，离心后重悬于测定缓冲液中，测定各组线粒体悬液荧光强度，激发波长为505 nm，发射波长为534 nm。

　　1.9 心肌组织冰冻切片ROS的测定

　　取新鲜的心肌组织，常规制作冰冻切片，清洗液浸泡15 s，根据试剂盒的步骤进行染色、清洗，完成后立即在荧光显微镜下观察：激发波长490 nm，散发波长520 nm，荧光强度越强，表明活性氧(ROS)含量越高。

　　1.10 统计学分析

　　所有资料采用SPSS16.0软件处理，计量资料以±s表示，多组参数比较采用单因素方差分析，P&<0.05表示差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 各组大鼠生存状况及死亡率

　　C组大鼠，毛色光亮，反应敏捷，食欲好，对声音及光线刺激敏感;M组大鼠毛色灰暗，脱毛明显，食欲减退，7周左右开始出现腹腔积液、气喘，对外界刺激反应迟钝;V组大鼠脱毛不明显，8周后，可见部分大鼠出现腹腔积液。M组大鼠死亡率为27%(4/15)，V组大鼠死亡率为20%(3/15)，死亡原因主要为心力衰竭。C组大鼠无死亡。

　　2.2 超声心动图检测结果

　　与C组比较，M组大鼠LVEDD及LVEDS均显著增大(P&<0.05)，LVEF及LVFS均显著下降(P&<0.05);V组与C组比较， LVEDD增大而无统计学差异，LVEDS显著增大(P&<0.05)，LVEF及LVFS均显著下降(P&<0.05);V组与M组比较，LVEF及LVFS均显著上升(P&<0.05)，LVEDS显著减小(P&<0.05)，LVEDD减小而无统计学差异。见表1，图1。表1 各组大鼠超声心动图检测结果

　　2.3 心肌线粒体超微结构观察结果

　　C组心肌细胞线粒体在肌丝下排列整齐，嵴清楚，结构正常。M组线粒体出现肿胀，嵴断裂，部分线粒体空泡化改变;V组线粒体有轻度肿胀，基质密度变淡，线粒体膜基本清晰，见图2。

　　2.4 心肌线粒体肿胀度的改变

　　0～10min内每分钟线粒体悬液ΔD值的结果显示，C组线粒体肿胀最明显，M组线粒体肿胀度较弱，而V组线粒体肿胀度趋于两者之间，见图3。

　　2.5 心肌线粒体膜电位的改变

　　与C组比较，M组及V组大鼠心肌线粒体ΔΨm水平均显著下降(P&<0.05)，而V组ΔΨm与M组比较有明显改善(P&<0.05)，见图4。

　　2.6 心肌组织ROS的测定

　　M组心肌组织ROS荧光较强;而C组心肌组织ROS荧光弱，分布稀疏;V组ROS荧光较正常对照组增强，而较模型组减弱，见图5。

　　3 讨 论

　　心肌线粒体作为多柔比星诱导心肌病的主要靶点，不仅因为线粒体影响ROS的生成，同时，线粒体还影响心肌细胞内钙离子的浓度及心肌细胞内能量的平衡，促进某些凋亡蛋白的表达[1]。本实验中，M组大鼠心腔明显最大，左室收缩功能减退，出现充血性心力衰竭表现，多柔比星诱导心肌病模型构建成功。对M组大鼠心肌线粒体超微结构、肿胀度和膜电位指标的观察中，发现多柔比星明显损害了大鼠心肌线粒体结构及功能，同时M组大鼠心肌组织内ROS生成增多。正常情况下ROS的生成主要是线粒体氧化呼吸过程中，内膜电子传递的副产品[3]。多柔比星进入心肌细胞后[4、5]，在线粒体NADH脱氢酶及微粒体NADPHP450还原酶作用下形成半醌自由基，再经过系列电子传递，形成ROS;同时，多柔比星还能与铁蛋白中的三价铁离子形成复合物，引起线粒体功能障碍，ROS生成增多。增多的ROS一方面会通过脂质过氧化及线粒体通透性转运孔道的开放影响线粒体膜结构及功能的完整性;另一方面，ROS也是细胞死亡及凋亡的主要诱导因子[4]。当ROS生成过度，而线粒体内能量生成过度减少可导致细胞死亡;当线粒体通透性转运孔异常开放时可以导致细胞色素c，AIF，Smac等促凋亡蛋白的释放，同时ROS生成过多削弱了线粒体膜两侧的质子梯度，导致ATP合成下降，诱导细胞凋亡。

　　缬沙坦作为一种AT1拮抗剂，能阻断血管紧张素Ⅱ介导的生物学效应，抑制血管紧张素Ⅱ的缩血管作用，减轻心脏的前后负荷，改善心脏舒缩功能，是临床上治疗充血性心衰的常用药物。Toko等[6]研究发现AT1基因剔除小鼠或野生型小鼠用AT1拮抗剂干预，可以防止多柔比星引起的急性和慢性心肌损伤。Nakamae等[7]在临床非霍奇金淋巴瘤CHOP(cyclophosphamide， adriamycin， vincristine， prednisolone)治疗中，试用缬沙坦干预多柔比星引起的急性心肌毒副作用。通过对心电图、心脏彩超及心衰生化指标的测定比较中，发现缬沙坦能缓解临床CHOP治疗中的心肌损伤。可见，缬沙坦能通过一定的途径改善多柔比星引起的心肌损害。Monteiro等[8]在急性心肌缺血动物模型中，观察到缬沙坦能改善线粒体内ATP的生成，维持线粒体内ATP依赖的心肌细胞结构与功能的完整性，从而改善心肌功能。Kuno等[9]在缺血性心衰动物模型中观察到，缬沙坦能减少心肌线粒体ROS的生成，减缓左室重构，从而改善左室功能，提高生存率。本实验结果显示，V组大鼠心肌组织内ROS生成减少，心肌线粒体超微结构及功能较M组有明显改善，而且V组大鼠心脏大小及功能也较M组明显改善。

　　综上所述，缬沙坦在干预多柔比星诱导心肌病病程进展过程中，能通过维护线粒体结构及功能的稳定，抑制ROS的过度生成，进而改善心肌的活力，延缓心室重构。

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