骨髓间充质干细胞的体内示踪及其修复椎间盘退变的实验研究

　　　　　　 作者：曹烨，吴小涛，王运涛，严慧深，邵建树

【摘要】 目的：探讨骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells，MSCs)的标记与体内示踪方法，及其治疗椎间盘退变的可行性。方法：取兔MSCs行体外培养，并在体外纯化扩增，用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)磁粒子标记后分别于1、3、5、7 d用MTT法检测细胞活性。将标记后的细胞植入退变的椎间盘内。分别于2、4、6、8周用间苯三酚分光光度法测定蛋白多糖含量的变化，免疫组化法测定Ⅱ型胶原含量的变化，用MR扫描对标记干细胞在椎间盘内分布进行示踪。所得数据进行统计学处理。结果：MTT法结果显示，SPIO对MSCs的生物活性无影响，MSCs能被SPIO有效标记。运用MR扫描可观察到其在体内的分布，并发现干细胞向周边发生了迁徙。8周内实验组髓核蛋白多糖和Ⅱ型胶原的含量高于模型组，差异有统计学意义。结论：SPIO可有效地标记MSCs并行体内活体示踪，且不影响细胞活性，是理想的示踪剂。SPIO标记后的MSCs移植能增加髓核中细胞外基质的含量，从而延缓椎间盘退变。

【关键词】 骨髓间充质干细胞; 超顺磁性氧化铁; 磁共振成像; 椎间盘退变; 兔

骨髓间充质干细胞(marrow mesenchymal stromal cells，MSCs)具有较强的自我更新和分化为多种成熟细胞的能力，由于它的这种特性，被广泛地应用于细胞组织工程中作为种子细胞进行研究。目前MSCs移植治疗疾病已在动物模型中取得初步成效，但MSCs移植后如何在活体内监测其存活、分布及迁徙情况仍需要做进一步的研究。随着分子成像技术的发展，应用超顺磁性氧化铁(superparamagnetic iron oxide，SPIO)标记干细胞，已成为体内示踪的重要手段[12]。目前已有研究显示，移植MSCs可能成为治疗椎间盘退变的一种新方法。本研究旨在探讨SPIO对细胞生物活性的影响及体内示踪效果，标记的干细胞移植是否能有效治疗椎间盘退变。

　　1 材料和方法

　　1.1 主要材料和试剂

　　LGDMEM培养基(美国Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、MTT(美国Sigma公司)，抗Ⅱ型胶原抗体(美国ADL公司)，DMSO(二甲基亚砜，西安化学试剂厂)，酶联免疫酶标仪(550型)(美国BIORAD公司)，1.5 T MR仪(荷兰Philips公司);新西兰大白兔由东南大学医学院动物中心提供。

　　1.2 实验方法

　　1.2.1 细胞培养 取1月龄新西兰大白兔6只(平均质量1.1 kg)，雌雄不拘，无菌条件下从双侧胫骨上端抽出骨髓血，密度梯度离心获得单个核细胞，加入含10%胎牛血清的DMEM培养液，置于5%CO2、饱和湿度、37 ℃培养箱。4～5 d后首次换液，以后每3 d换液1次。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。细胞生长融合达90%以上，以0.25%胰蛋白酶消化，按1传2比例分瓶接种传代培养。此为传1代，记为P1，以此类推，分别获取P2、P3、P4…P10间充质干细胞。以P3细胞作为注射用细胞。

　　取MSCs细胞悬液进行计数，调整细胞密度为1×106 ml-1并行台盼蓝染色。镜下观察，在3 min内用血细胞计数板分别计活细胞和死细胞数，死细胞被染成淡蓝色，而活细胞拒染。活细胞率(%)=活细胞数/(活细胞数+死细胞数)×100%。

　　1.2.2 兔MSCs的SPIO纳米粒子标记 据文献[3]报道，将SPIO纳米粒子(东南大学纳米技术研究中心)加入细胞培养液中，标记Fe质量浓度为25 μg·ml-1，于37 ℃、5%CO2培养箱内共同孵育24 h，弃去培养液后PBS反复冲洗。胰酶消化收集MSCs，使MSCs再次悬浮成单个细胞。同时一部分标记过的细胞进行普鲁士蓝染色观察细胞内铁。

　　1.2.3 MTT检测 准备4块96孔培养板，取MSCs单细胞悬液，调整细胞浓度约1×106 ml-1，接种于96孔培养板(200 μl·孔-1，n=4)。每块培养板设标记细胞培养组、未标记细胞培养组及空白对照组(调零)。分别用于连续培养1、3、5、7 d，终止培养前4 h加入0.5%MTT(20 μl·孔-1)，继续培养4 h，加入DMSO150 μl置于室温下15～20 min，震荡培养板10 min使染色均匀，采用酶联检测仪在490 nm波长测定各孔吸光度值，计算出各组的均值。各样本均数之间的比较采用t检验。

　　1.2.4 分组及手术方法 纯种成年新西兰大白兔36只，雌雄不限，平均质量2.5 kg，随机选取24只行椎间盘退变模型手术，余下12只设为对照组。在全麻下采用腰椎侧前方倒八字手术入路，于腹膜外进入腰椎的侧前方，找到腰椎间盘，于L23、L34、L45椎间隙，用21号针头针刺抽吸椎间盘，抽出组织湿质量4～5 mg。造模成功后，术后2周，把模型兔随机分为实验组及模型组，每组各12只，同上述手术方法，实验组在对应的椎间盘内注射SPIO标记的干细胞悬液25 μl，模型组在对应的椎间盘内注射磷酸缓冲液(PBS)25 μl，在每个相应椎间盘旁的腰大肌处以黑色缝合线作标记，用于以后取样观察。然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口。术后每日定期观察切口情况，肌肉注射抗生素预防感染。

　　1.2.5 MR扫描 在2、4、6、8周，每组随机选取2只兔行MRI检查。观测移植入椎间盘标记细胞的信号强度、范围，随时间的部位迁徙及信号强度、范围的改变。

　　1.2.6 蛋白多糖含量测定 将以上3组每组随机分为2、4、6、8周组4个亚组，每个亚组3只兔。在相应时间于兔耳缘静脉注射空气10 ml处死，立即取出兔腰椎并辨认原椎间盘定位标记，确认3组相应椎间盘。采用间苯三酚分光光度法测定吸光度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。

　　1.2.7 病理学检测方法 取出的相应椎间盘置10%中性福尔马林保存，常规脱水、透明、石蜡包埋、切片、免疫组化检测，一抗为抗兔Ⅱ型胶原的单克隆抗体(1∶100)，DAB显色。免疫组化结果判断：阳性细胞间质呈棕黄色，应用LeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件定量评价呈阳性免疫染色的髓核细胞间质的灰度值(灰度分级0～255级，0级为最深，255级为最浅)，每只兔选取2张切片，每组共6张，每张切片随机采集4个高倍视野(×200)进行测定(向同一个方向移动切片，不重叠，不重复)。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。同时取实验组部分病理切片行普鲁士蓝染色观察标记的干细胞。

　　1.3 统计学处理

　　运用SPSS 15.0软件进行统计学分析。结果用x-±s表示。多组间比较运用单因素方差分析F检验，组间两两比较采用SNK检验，检验水准α=0.05。

　　2 结 果

　　2.1 兔MSCs原代培养生长及形态观察

　　原代细胞接种后24 h即有细胞开始贴壁生长，呈类圆形或细小梭形;5～7 d后细胞集落逐渐增多扩大，并彼此融合，细胞呈现梭形外观;10～12 d细胞融合达90%以上，细胞呈栅栏状、漩涡状排列，细胞间的界限不清，可以传代。

　　MSCs的活率：传代至P3的细胞，经0.25%的胰蛋白酶消化后制成细胞悬液，台盼蓝排斥试验检测细胞活率达95%。

　　2.2 SPIO标记的干细胞

　　SPIO标记的MSCs经普鲁士蓝染色后在光镜下观察，细胞胞浆内分布有大量的蓝黑色铁颗粒，标记率为100%(图1)。

　　2.3 MTT结果

　　相同培养时间标记细胞培养组与未标记细胞培养组之间的A值差异无统计学意义(P&>0.05);随着培养时间的延长，两组的A值都逐渐增高(表1)。

　　2.4 MR扫描

　　移植干细胞的髓核，不同时间MRI T2像对比，早期髓核T2像形成一个低信号区，周围为高信号的髓核组织，而后期的髓核T2像即表现为均一的低信号，提示SPIO标记的干细胞植入髓核内后由移植中心区向周边髓核发生迁徙(图2)。表1 两组不同培养时间的吸光度值

　　2.5 蛋白多糖含量测定结果

　　术后2、4、6、8周，将各组的蛋白多糖测定值经方差分析，差异有统计学意义(P&<0.05)。各组间再行两两比较采用SNK检验。各个时间点实验组与模型组及模型组与对照组之间，差异有统计学意义(P&<0.05)(表2)。表2 不同时期各组髓核蛋白多糖含量

　　2.6 病理学检测结果

　　实验组和对照组髓核组织Ⅱ型胶原染色呈阳性或强阳性，模型组呈阴性或弱阳性反应(图3)。术后2、4、6、8周，各组间测定值经方差分析，差异有统计学意义(P&<0.05)。各组间两两比较采用SNK检验。各个时间点实验组与模型组及模型组与对照组之间，差异有统计学意义(P&<0.05)(表3)。实验组病理切片行普鲁士蓝染色观察到蓝黑色颗粒，这表明SPIO颗粒仍停留在移植的干细胞内(图4)。

　　3 讨 论

　　存在于骨髓中的MSCs是一种成体干细胞，具有可以分化成各种间充质来源的结缔组织细胞的潜能，其分化结果由其最终定居环境决定，在合适的条件下可以分成化骨、软骨、脂肪等[4]。其来源广泛，采集容易、增殖能力强、体外培养时易扩增等特点，使其可以作为潜在的种子细胞，因此常作为移植用细胞治疗疾病。

　　干细胞植入体内后，需要对移植细胞在体内的存活、迁徙、分布等情况进行监测。目前国内外大都采用体外标记后再植入体内的方法，主要采用荧光染料、核素、基因转染等标记方法。然而，上述标记方法需要离体状态下进行组织学切片分析和鉴定，这类侵袭性的方法不能动态观察移植细胞在活体宿主体内的生长存活情况。自1999年Weissleder[5]提出分子影像学概念以来，分子成像技术迅速兴起，为无创动态地监测活体内移植细胞提供了新的途径。尤其是SPIO纳米粒子标记干细胞技术的日益成熟，MR活体示踪磁标记干细胞逐渐成为研究的热点。SPIO是目前最新的细胞标记物，该纳米颗粒是一种负性对比剂，MR T2WI呈现低信号，由于其粒径小，穿透力强，很低浓度(nmol级)即可在MR上形成对比，且SPIO具有生物可降解性，能被细胞代谢后进入正常血浆铁池，较为安全，因此可以起到活体示踪作用。Pastor[6]的研究显示，经SPIO标记的MSCs仍具有分化为成骨细胞及脂肪细胞的能力，且将标记后的MSCs经血管注射后可在正常的肾皮质发现信号减低。本研究在移植前细胞行SPIO标记，标记Fe质量浓度为25 μg·ml-1，普鲁士蓝染色显示标记的纳米磁粒子位于细胞的胞浆中，标记率100%。MTT实验表明该浓度下细胞内的磁粒子对细胞的生物活性没有影响，说明SPIO标记干细胞是安全的，与未标记细胞相比，标记细胞内的SPIO不影响干细胞的存活与生物活性。表3 不同时期各组髓核组织Ⅱ型胶原定量分析

　　近年来研究发现，椎间盘退变往往伴随着椎间盘细胞数目的减少和综合活力下降，基质成分的产生和降解平衡被打破，导致了基质的净丢失。因此利用细胞移植可增加椎间盘正常细胞量，并能促进细胞外基质的合成与代谢，有缓解甚至逆转椎间盘退变进程的可能。Sakai等用绿色荧光蛋白标记的自体MSCs移植入兔退变椎间盘模型后发现，退变椎间盘的高度、细胞基质得以恢复并证明植入后的MSCs表现出一些类软骨细胞的特征性表型[7]。国内有研究用TGFβ1干预下的兔MSCs移植到退变的椎间盘后，发现在一定时间内可以增加蛋白多糖和Ⅱ型胶原含量[8]。上述研究证明了MSCs移植治疗椎间盘退变的可行性。本实验研究采用SPIO标记的MSCs进行移植修复椎间盘退变。研究发现各时间点实验组髓核中Ⅱ型胶原及蛋白多糖的含量均高于模型组，差异有统计学意义，说明标记过的MSCs的生物活性未受影响，移植后仍能增加髓核的细胞外基质含量。同时利用MR对干细胞移植后的迁徙、增殖情况进行动态观察，提示干细胞植入髓核内后由移植中心区向周边髓核发生迁徙。Sobajima等[9]在兔模型上发现MSCs的位置和时间有密切关系：在12周以前，干细胞主要位于髓核;但在24周后，可观察到干细胞向纤维环区域迁移，并在形态学上表现出更接近于自体纤维环细胞的特征。干细胞发生迁徙的机制目前尚未见报道，有待进一步研究。

　　本实验结果说明，用SPIO可以标记MSCs且对细胞活性无影响，标记细胞移植后在体内能观察到明显的MR信号改变，可对细胞移植后在活体内的迁徙情况提供影像学证据，SPIO标记后的干细胞对椎间盘退变有修复作用。这为临床上干细胞移植后对其在活体内存活、分布和迁徙情况进行研究，提供了无创性的影像学依据，有助于进一步研究MSCs移植治疗椎间盘退变性疾病。

参考文献

　　[1]HSIAO J K，TAI M F，CHU H H，et al.Magnetic nanoparticle labeling of mesenchymal stem cells without transfection agent:cellular behavior and capability of detection with clinical 1.5 T magnetic resonance at the single cell level[J].Magn Reson Med，2007，58(4): 717724.

　　[2]ERIC F，PIOTR W，PREDRAG P，et al.Effects of iron oxide incorporation for long term cell tracking on MSC differentiation in vitro and in vivo[J].Biochem Biophys Res Commun，2008，(369):10761081.

　　[3]居胜红，藤皋军，毛曦，等.脐血间充质干细胞磁探针标记和MR成像研究[J].中华放射学杂志，2005，39(1):101106.

　　[4]CAPLAN A I.Mesenchymal stem cells[J].J Orthop Res，1991，9:641650.

　　[5]WEISSLEDER R.Molecular imaging: exploring the nest frontier[J].Radiology，1999，212:609614.

　　[6]PASTOR C M.Tracking mesenchymal stem cells in the liver by magnetic resonance imaging[J].J Hepatol，2005，43(5):915916.

　　[7]SAKAI D，MOCHIDA J，IWASHINA T，et al.Differentiation of mesenchymal stem cells transplanted to a rabbit degenerative disc model:potential and limitations for stem cell therapy in disc regeneration[J].Spine，2005，30(21):23792387.

　　[8]赵梓汝，吴小涛，王运涛，等.TGFβ干预下体内兔骨髓间充质干细胞对椎间盘退变治疗的实验研究[J].中国矫形外科杂志，2006，14(13):10191022.

　　[9]SOBAJIMA S，VADALA G， SHIMERA A，et al.Feasibility of stem cell therapy for intervertebral disc degeneration[J].Spine J，2008，8(6):888896.