地塞米松对哮喘小鼠气道炎症反应和STAT6表达的影响

【摘要】 目的： 研究地塞米松对支气管哮喘小鼠急性气道炎症反应的作用及对信号转导子和转录激活子6(STAT6)表达的影响。方法： 用免疫组织化学法检测给予地塞米松后哮喘小鼠肺组织中STAT6的表达。结果： 哮喘组小鼠肺泡灌洗液(BALF)中细胞总数、嗜酸粒细胞(EOS)绝对值显著高于对照组(P&<0.01)，上述炎症细胞计数地塞米松组比哮喘组明显减少(P&<0.01) 。HE染色示地塞米松组小鼠气道炎症反应程度较哮喘组减轻。STAT6在气道上皮细胞表达，哮喘组气道上皮细胞中STAT6 表达较对照组增加，地塞米松组STAT6表达与哮喘组比较明显减少，较对照组增加。支气管上皮细胞STAT6蛋白与BALF中的EOS绝对值呈显著正相关。结论： 地塞米松可在一定程度上减轻哮喘小鼠的气道炎症反应，作用机制可能是通过下调肺脏组织中STAT6蛋白的过度表达，从而抑制依赖于STAT6/IL4通路的急性气道炎症反应。

【关键词】 支气管哮喘;信号转导子和转录激活因子6;Th1/Th3;地塞米松;小鼠

糖皮质激素在治疗哮喘方面的一线作用已勿庸置疑， 其可以抑制多种炎症细胞的活化和炎症因子的生成及释放，降低血管通透性，提高β2受体的敏感性，对于哮喘的急性炎症及慢性气道重塑都有肯定的疗效[12]。本研究作者通过观察地塞米松对哮喘小鼠气道炎症反应的影响及信号转导子和转录激活子6(STAT6)在气道上皮细胞的表达情况，探讨地塞米松治疗哮喘的分子机制，为临床治疗提供理论依据。

　　1 材料与方法

　　 1.1 材料

　　1.1.1 实验动物及分组 24只清洁级BALB/c小鼠，雄性，6周龄，体重18～20g， 由扬州大学实验动物中心提供，许可证号为SCXK(苏20070001)。采用随机数字法将小鼠随机分为哮喘组、地塞米松组和对照组3组，每组8只。哮喘组、地塞米松组分别于第0、7天腹腔注射0.2ml致敏液[含卵白蛋白(OVA)100μg加氢氧化铝400μg的生理盐水溶液]，14d后将小鼠置入自制密闭箱(30cm×45cm×54cm)内，用10g·L-1OVA溶液超声雾化激发哮喘，30min·d-1，连续7d。地塞米松组每次激发前半小时予地塞米松2mg·kg-1腹腔注射;对照组全部以生理盐水代替。

　　1.1.2 标本采集 3组小鼠在OVA最后1次激发后24h眼球摘除采血，颈椎脱臼处死小鼠，打开胸腔，结扎左肺门根部，取出左肺投入10%中性福尔马林溶液中固定。颈前暴露气管，做横形切口插入静脉留置针，进行右侧支气管肺泡灌洗。

　　1.1.3 主要仪器和试剂 勃林格殷格翰超声雾化器、台式离心机购自上海安亭科学仪器厂，自制密闭箱、OVA(Grade Ⅱ)、氢氧化铝凝胶购自美国Sigma公司。地塞米松磷酸钠注射液购自浙江仙居制药股份有限公司，兔抗小鼠STAT6多克隆抗体购自美国Cell Signaling公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肺泡灌洗液(BALF)的留取 在环状软骨上用血管钳固定气管，其下作横行切口，置入连接注射器的硅胶管，分3次缓慢注入生理盐水，每次注入量为0.3ml，每次灌洗后立即回收置于离心管中，计量，回收率约80%以上，于-4℃储存，2h内作细胞分离。

　　1.2.2 BALF中细胞总数和嗜酸粒细胞(EOS)计数 采用离心机对BALF液以1500r·min-1离心10min，细胞沉淀用0.5mlPBS液重悬，取0.1ml于血细胞计数台测定细胞总数，WrightGiemsa染色进行细胞分类计数，EOS绝对值计数使用伊红染液染色。

　　1.2.3 HE染色 取左肺以中性福尔马林固定，石蜡包埋后切片，行HE染色。每只各做5张切片，观察支气管及周围的炎症细胞浸润情况。

　　1.2.4 免疫组织化学法检测肺组织STAT6蛋白表达 肺组织STAT6表达检测步骤按SP使用说明书进行。一抗:STAT6兔抗小鼠多克隆抗体，稀释度为1∶400;二抗及检测试剂盒为SP工作液，3，3二氨基苯联胺(DAB)显色，苏木精复染，阳性细胞核着色呈棕黄色。本实验STAT6蛋白阳性表达主要集中于各级支气管(细支气管、终末细支气管和呼吸性细支气管)的上皮细胞。显微镜下观察组织着色情况，细胞质清晰、染色呈棕色为阳性，采用图像分析软件(ImagePro plus 4.5)对STAT6阳性部位进行原位定量检测，每张切片随机选用5个视野(10×40)，自动选取阳性部位并计算相对IOD值。

　　1.2.5 统计学处理 采用SPSS13.0统计学软件，对样本先行正态性和方差齐性检验，条件满足时，用单因素方差分析(One Way ANOVA)及多重比较方法进行检验。条件不满足时，用多组比较的秩和检验(KruskalWallis H test)比较总的差异，相应的多重比较方法进行两两比较。P&<0.05认为差异有统计学意义。两变量相关分析采用Bivariate过程中的Pearson等级相关法。

　　2 结 果

　　2.1 小鼠症状、体征的改变

　　哮喘组小鼠经抗原激发后表现为烦躁不安、呼吸急促和腹肌抽搐等症状，严重者呼吸减慢或节律不规则，行动迟缓，反应迟钝甚至瘫痪，毛色失去光泽。地塞米松组激发后的表现较哮喘组明显减轻，个别小鼠甚至基本无症状。

　　2.2 小鼠肺组织病理学改变

　　对照组小鼠外观肺包膜光滑，弹性好，镜下气道黏膜上皮完整，无纤毛脱落，偶见杯状细胞;肺组织结构完整，肺泡腔清晰，肺泡隔无水肿、炎症等改变。 哮喘组小鼠肺组织体积轻度增大、肿胀，肺组织切片HE染色可见气道上皮不完整，上皮细胞破坏，支气管、血管周围大量炎症细胞浸润，以EOS和淋巴细胞为主，气道内黏液分泌。地塞米松组小鼠炎症改变明显减轻，支气管壁周围仅有少量炎症细胞浸润。

　　2.3 BALF中的细胞总数及EOS计数

　　哮喘组小鼠支气管BALF细胞主要由巨噬细胞和EOS组成，细胞总数及各种炎症细胞较对照组增加(P&<0.05)，地塞米松组上述炎症细胞明显减少(P&<0.05) ，见表1。表1 各组BALF中细胞总数及EOS计数(x±s)

　　×105ml-1

　　组 别n细胞总数EOS计数对照组87.96±0.620.08±0.061) 地塞米松组89.02±2.501)0.29±0.091)哮喘组818.18±2.172)，3)1.73±1.012)，3) 1) 与哮喘组比较，P&<0.05; 2) 与对照组比较，P&<0.05;3)　与地塞米松组比较，P&<0.052.4 气道上皮STAT6阳性细胞的表达

　　免疫组织化学检测显示，各组的气道上皮细胞均有不同程度STAT6表达。对照组多数气道上皮细胞不着色，仅见少量散在的STAT6阳性细胞(图1);而哮喘组的细胞质和细胞核都有阳性染色，其气道周围浸润的炎症细胞中也有STAT6的表达(图2);使用地塞米松干预后，STAT6蛋白在细胞内的分布明显减少(图3)，差异具有统计学意义(P&<0.01)。

　　图1 对照组肺组织STAT6的表达 免疫组织化学×400图2 哮喘组肺组织STAT6的表达 免疫组织化学×400图3 地塞米松组肺组织STAT6的表达 免疫组织化学×400

　　2.5 相关性分析

　　相关分析表明，支气管上皮细胞STAT6表达与BALF中的EOS绝对值呈显著正相关(r=0.748，P&<0.01)。

　　3 讨 论

　　支气管哮喘是多基因遗传和环境因素相互作用的变态反应性疾病，各种因素包括EOS、T淋巴细胞、气道上皮细胞等及其分泌的几十种细胞因子共同参与引起气道慢性炎症，继而气道高反应性和可逆性气流受限。临床上使用糖皮质激素治疗哮喘可以明显减轻哮喘的症状，减少发作次数和改善肺功能，疗效已得到肯定。其作用可能是通过抑制淋巴细胞与巨噬细胞及其分泌的多种细胞因子的合成，抑制EOS的趋化与活化，减少白三烯和前列腺素的合成并抑制其代谢，促使小血管收缩、增高其内皮的紧密度、减少血管渗漏，抑制炎症细胞趋化，活化并提高呼吸道平滑肌β2受体的反应性和增加细胞膜上β2受体的合成，抑制组胺酸脱羧酶、减少组胺的形成，增加PGE受体的数量，抑制支气管腺体中酸性黏多糖的合成，减少血浆素原激活剂的释放及弹性蛋白酶和胶原酶的分泌等[3] ，从而抑制炎症反应和延缓气道重塑，使哮喘的临床症状得以控制。本实验中发现哮喘组小鼠行动迟缓，呼吸急促，其肺脏体积增大、肿胀。病理切片可见气道上皮不完整，上皮细胞破坏，支气管、血管周围有大量炎症细胞浸润，以EOS和淋巴细胞为主。气道内有黏液栓形成，提示哮喘模型是成功的。而地塞米松组上述症状减轻，病理切片可见有少量杯状细胞，支气管壁周围仅有少量炎症细胞浸润。

　　目前关于糖皮质激素作用机制的研究达到分子水平，认为这种小分子脂溶性物质容易通过细胞膜进入细胞内，与胞质中的受体结合，活化的激素受体复合物随后转移至细胞核，链接在糖皮质激素敏感基因启动子区的应答元件DNA位点，调控DNA的转录和蛋白质合成，从而发挥其生物学效应。So等[4]研究发现，糖皮质激素可调控靶基因的转录，抑制STAT6 的磷酸化及减少STAT6 与CD23 启动子结合，从而抑制IL4的分泌，并通过下调JAK1及STAT6表达抑制IL4和IL13的进一步升高，防止气道上皮细胞的增生，杯状细胞化生和黏液合成增加，气道上皮下胶原沉积减少，αSMA表达下调，从而控制哮喘气道重塑的进展[5] 。但也有实验提出，吸入糖皮质激素并不能用于防止气道重塑[6] 。而Heller等[7]也发现，气道上皮细胞STAT6表达、激活、核转移以及与靶基因结合均不受糖皮质激素的影响。本实验中作者发现，地塞米松组与哮喘组小鼠相比，气道及肺组织中STAT6表达明显减少，该过程伴随着动物BALF中白细胞、EOS的减少，气道炎性浸润减轻，杯状细胞减少等，提示治疗有效， 与文献报道是一致的，证实了STAT6信号转导途径在调控变应性疾病的基因表达方面起重要作用。

　　相关性分析表明，小鼠气道上皮STAT6含量与BALF中EOS减少水平呈正相关(r=0.748)。我们既往的实验也证实了地塞米松能降低哮喘小鼠血清及BALF中明显升高的IL4的浓度[8] 。这些均提示地塞米松可使哮喘小鼠肺组织中STAT6磷酸化水平降低，由其调控的Th3细胞因子IL4的浓度随之降低，表现为气道炎症减轻，血管通透性下降， 局部充血、渗出和白细胞浸润的程度均有所减轻，哮喘的症状得以控制。推测地塞米松抑制气道炎症、治疗哮喘的作用机制之一可能是通过影响小鼠气道炎症细胞STAT6的表达，从而部分抑制依赖于STAT6/IL4 通路的急性炎症。

参考文献

　[1]GHAFFAR O，CHRISTODOULOPOULOS P，LAMKHIOUED B，et al.In vivo expression of signal transducer and activator of transcription factor 6(STAT6) in nasal mucosa from atopic allergic rhinitis: effect of topical corticosteroids[J].Clin Exp Allergy，2000，30：8693.

　　[2]丁敏娇，戴元荣.糖皮质激素防治支气管哮喘患者气道重塑的研究进展[J].中华结核和呼吸杂志，2005，28：656658.

　　[3]DONIEC Z.Antiinflammatory action of corticosteroids in bronchial asthmamechanism of action and pathophysiologic aspects [J].Pneumonol Alergol Pol，1997，65(Suppl1):6670.

　　[4]SO E Y，KIM S H，PARK H H，et al.Corticosteroid inhibits IL4singaling through downregulation of IL4 receptor and STAT6 activity[J].FEBS Letters，2002，518：5359.

　　[5]陈晓红，钟南山，张卫东，等.布地奈德对哮喘小鼠气道重塑及JAK1/STAT6表达的影响[J].中华医学杂志，2007，87：16271632.

　　[6]PANETTIER R A.Effects of corticosteroids on structural cells in asthma and chronic obstructive pulmonary disease[J].Proc Am Thorac Soc，2004，1：231234.

　　[7]HELLER H M，MATSUKURA S，GEORAS S N.Assessment of signal transducer and activator of transcription 6 as a target of glucocorticoid action in human airway epithelial cells[J].Clin Exp Allergy，2004，34：16901700.

　　[8]张祖贻，杨远，张见平.CpG ODN对哮喘小鼠Th1/Th3相关细胞因子表达的影响[J].江苏医药，2002，28(3):164166.