超声微泡在缺血性疾病治疗中的应用研究进展

　　　　　　作者：施晓宇　范国峰　童嘉毅

【关键词】 超声波　微泡造影剂　溶栓　血管新生　干细胞

　　随着超声影像新技术的不断发展和超声造影剂制备技术的不断改进，超声微泡在疾病诊断和治疗中的作用日趋重要。近年来国外开始了靶向超声微泡治疗疾病的相关研究，将超声微泡作为一种载体，利用超声波与微泡造影剂的相互作用及所产生的生物学效应，实现所携带药物及基因等向靶组织的转移释放，起到靶向治疗的作用。现仅就超声介导微泡在缺血性疾病治疗中的相关应用研究作一综述。

　 1 超声微泡及其效应

　 1.1 超声微泡

　 微泡由核心及外壳两个部分组成，核心由二氧化碳、氧气、空气或大分子惰性气体(多为氟烷气体)等构成，外壳(即包膜)可由磷脂类化合物、白蛋白、糖类、非离子表面活性剂或可生物降解的高分子多聚物等不同材料组成。不同类型外壳的微泡造影剂具有不同的特性和应用价值，多数研究选用含有全氟显气体的白蛋白或脂质外壳的微泡。新近研究的纳米级微泡，如液态氟碳微泡，直径小于100 nm，能够穿过血管内皮细胞间隙，在体内循环半衰期长，可用作超声、CT、MRI造影剂，连接放射性物质还可作为核医学造影剂。

　　　1.2 超声介导微泡的机械及生物学效应

　　1.2.1 超声辐射力

　　超声在声波传播方向产生原发性辐射力，使微泡向血管壁移位，流动速度下降；同时微泡之间产生继发性辐射力，使微泡间黏附增加。在超声辐射力的作用下，微泡在局部血管的黏附力可增加20倍以上［1］。

　　1.2.2 空化效应

　　空化效应指液体中存在的微小气泡(空化核)在声波作用下产生的振荡、扩大、收缩至内爆等一系列动力学过程。血液中存在微泡造影剂时，微泡相当于血液中的空化核，当声压大于100 kPa时，就会产生空化效应。声强度较小时，微泡围绕平衡半径振荡，称为稳态空化。在每一个振荡微泡周围的不均一环状区域将会产生直径较小的稳定、均匀的血流束，称为微束，其速度及切变率与微泡振动幅度成正比。当声强度继续增加时，微泡在超声作用下剧烈振荡，先膨胀后迅速萎陷。气泡内爆的瞬间，泡内聚集的能量(理论上可达声波能量的1011倍)迅即释放出来，在空化发生的微小空间内形成高温(5 000 K以上)、高压（107 Pa以上），称为瞬间空化。瞬间空化所产生的高温可以引起光辐射，导致分子内部键裂解而形成自由基。如果瞬间空化发生在固体表面附件，微泡呈不对称塌陷，产生冲击波和碰射流，可损伤固体表面［2］。

　　1.2.3 声孔效应

　　1997年Bao等［3］首次发现含微泡的中华田鼠卵巢细胞悬浮液经超声辐照后，细胞膜对胞内外大分子通透性暂时开放，随后闭合，称此为声孔效应。2000年Ward等［4］研究淋巴细胞悬浮液发现，当辐照时间一定、微泡浓度增高或者微泡浓度不变、超声辐照剂量增加时，出现两种声孔效应，即可修复性声孔效应和致死性声孔效应。目前认为低于瞬间空化阈值时，声孔效应是微束所产生的剪切力作用；当高于瞬间空化阈值时，声孔效应则由不均一的微泡萎陷时产生瞬间空化所引起。

　 2 超声微泡在缺血性疾病治疗中的应用

　　2.1 溶栓治疗

　 血栓形成和栓塞是缺血性疾病，如急性心肌梗死、脑卒中的关键因素，及时、有效的溶栓治疗常能挽救患者生命。目前溶栓治疗中，静脉药物溶栓的药物剂量大，出血等并发症多；经介入选择性动脉药物溶栓的药物剂量虽减少，但治疗条件要求高，费时多，花费昂贵，尚不能充分开展。而国内外已有研究证实，一定条件下，超声联合微泡可以溶解血栓，并且不会引起出血等并发症。1995年Thomas等［5］首次报道了真正有实际意义的超声联合微泡促进溶栓的实验。此后一系列的研究结果［6］表明，超声介导微泡可获得优于单纯超声辐照的溶栓效果，而且在体内外实验中，以微泡加超声加溶栓药联合应用可获得更好的溶栓效果。

　 此外，在微泡表面结合能识别纤维素或血凝块成分的配体，将溶栓药置于微泡膜的内层和外层之间，携带溶栓药物到达靶位点的靶向溶栓治疗也正在研制中。Unger等［7］报道MRX 408脂质微泡可结合特异性寡肽，与活化血小板的GP Ⅱb/Ⅲa受体具有强的亲和力，显微镜下观察发现，微泡可特异性地结合到血凝块上，不仅被血栓周边或表面摄取，而且吸收到血栓块的深部。近期已成功构建含活性气体NO的超声微泡，体外实验进一步证实超声破坏微泡释放NO能够进一步增强溶栓作用［8］。

　　　目前认为，超声微泡溶栓、助溶作用主要是空化效应。空化效应增宽血栓中纤维蛋白链的间距，增强血栓的“多孔性”，使药物和微泡更易于向血栓内渗透。即使在没有外源性溶栓药物的情况下，内生性纤维蛋白溶酶激活剂向血栓内的渗入也会被增强。

　 2.2 携带基因治疗

　　　随着对疾病分子机制的认识和人类基因组研究的进展，基因治疗成为一种新的有前景的治疗方法。但目前基因治疗还存在一些问题，如缺乏安全、有效、有组织特异性和靶向性的基因转载系统，缺乏稳定的表达和转录后的宿主反应等。目前基因导入的方式多为将目的基因直接注射于靶组织，如心血管疾病多采用心肌内直接注射方法，或向心导管注入质粒DNA或腺病毒载体，但其有创性和转染效率低等缺点限制了其临床应用。

　　　超声微泡造影剂为基因治疗提供了一种安全、高效的新型载体，研究涉及心脏、血管、肝脏、肾脏、神经系统、肿瘤等众多领域，特别是缺血性疾病如心肌梗死、外周动脉疾病的基因治疗。猪冠状动脉再狭窄模型中，应用微泡靶向递送反义硫代磷酸化寡核苷酸转染冠状动脉，可以抑制血管内膜增生［9］；同样，应用Optison微泡靶向转染E2F基因可以明显抑制球囊损伤后的兔颈动脉血管内膜增生［10］。与局部骨骼肌单独注射编码绿色荧光蛋白(GFP)的裸质粒相比，注射携带GFP质粒的Optison，超声能明显增加GFP表达量，同时减轻肌肉损伤［11］。此外，Tiukinhow等［12］证实，静脉注射携带肝细胞生长因子的Optison，超声作用后可以增加兔骨骼肌毛细血管密度，改善局部供血。

　　　超声破坏微泡增强DNA靶向递送的可能机制：（1）DNA通过微泡在靶向区域裂解被释放，提高目标部位浓度；（2）稳定空化微泡周围可产生环状涡流和强大的切变率，加速DNA扩散；（3）超声微泡作用下血管壁通透性增加，细胞膜渗透性提高。
　　
　　2.3 促进血管新生

　　　动脉粥样硬化斑块进展或破裂引起受累器官供血减少是缺血性疾病的主要病因。通过递送细胞因子、生长因子基因或蛋白至缺血组织，作用于血管内皮细胞，诱导其增殖、迁徙以及治疗性血管生成，已证实能够增加局部血流灌注，改善器官功能。Song等［13］于2002年首次通过实验证明，超声破坏微泡使大鼠后肢骨骼肌小动脉密度较对照组增加约65%，同时小动脉直径也增加，局部血流量增加约57％。其进一步实验［14］表明，超声联合微泡能够靶向促进大鼠缺血后肢小动脉生成，改善缺血区营养血流量。

　　　超声介导微泡促进血管新生的机制为：（1）超声破坏微泡的空化效应引起直径≤7 μm的微血管破裂，而对大血管无影响，是对机体的无菌性炎症刺激，诱导局部产生炎症反应，炎症细胞（如巨噬细胞、T淋巴细胞）在局部浸润并释放血管生长因子(主要是VEGF)，从而促进小血管新生［15］；（2）通过CD18依赖机制募集骨髓来源的单个核干细胞参与血管新生，但不直接分化为血管内皮细胞［16］。

　　　超声介导微泡可刺激血管形成，但新生血管是渗透、迂曲的，血管管径不一致，是否能维持微循环还有待进一步研究；此外目前的实验研究大多在大鼠骨骼肌模型上进行，在大动物乃至人体以及心肌组织是否有同样的效应仍不清楚。

　 2.4 增效干细胞治疗

　　　随着细胞生物工程技术的发展和对干细胞研究的不断深入，采用生物学技术，将不同组织来源的干细胞通过不同的途径进行干细胞移植治疗，以期替代、修复或改善受损缺血组织的生物学功能，显示出良好的临床应用前景。目前研究较多的是干细胞移植治疗心肌梗死，但还存在移植细胞数量、途径、安全性及作用机制等急需解决的基本问题。动物及临床研究提示，干细胞移植治疗缺血性心脏病能够改善心肌功能，但效果仍不肯定，甚至相互矛盾。

　 国内外动物实验［1720］均表明，超声联合微泡促进移植干细胞缺血区归巢数量，增强血管新生和小动脉生成，改善缺血骨骼肌和心肌局部血流量，恢复心肌收缩功能和骨骼肌运动功能，并且对移植干细胞增殖、凋亡和细胞周期无不良影响［21］。超声介导微泡增效干细胞治疗的机制目前仍不明确，推测和下列因素有关：（1）空化效应引起局部炎症反应，局部聚集巨噬/单核细胞、血小板分泌炎症因子（如TNF、IL1），促进内皮细胞表达黏附分子（如P选择素、ICAM1、VCAM1），增加移植干细胞黏附内皮细胞［1314］；（2)体外研究表明，超声介导微泡作用下，邻近内皮细胞对胞外大分子物质通透性增加，该作用可持续3 min左右，而且血管内皮细胞间隙增宽［19］，可能使移植干细胞在缺血局部迁移增多；（3）超声微泡能够增加局部组织生长因子（如VEGF、bFGF）mRNA表达和生成，促进移植干细胞增殖和分化，同时发挥旁分泌治疗作用［18］。

　 3 目前存在问题
　　
　　近十几年来，超声微泡的研究取得了明显进展，使用领域越来越多，但随着对超声波及微泡认识的深入，人们也逐渐认识到对它们的广泛应用目前还存在一些问题有待解决。超声介导微泡发生过多瞬间空化，可引起毛细血管破裂、红细胞外渗、内皮细胞破坏、血管内溶血、体外培养细胞和含气组织及器官(如肺和肠)损伤。超声破坏微泡作用于离体大鼠心脏，可引起心室收缩功能可逆、短暂性的降低，冠状动脉灌注压的增高和心肌组织内乳酸盐的过量沉积，与超声机械指数呈正相关［22］。这一系列的副作用可能直接归因于超声破坏微泡所引起的机械作用，因此，有必要对超声介导微泡治疗相关疾病的超声参数进行更深入的优化，同时改进超声微泡的制作工艺，从而充分发挥有益的生物学效应，减少可能的组织损伤。

　　　综上所述，随着分子生物学、物理化学及材料学(包括纳米技术)等新技术在超声及造影剂微泡中的应用，超声微泡造影剂在疾病诊断和治疗领域具有广阔的发展前景。随着生物工程研究的发展和对疾病认识的深入，超声联合微泡治疗缺血性疾病将会得到越来越广泛的应用，有望成为一种有效、无创、经济、安全的新治疗手段。

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