外源性FHIT基因转染对人胃癌细胞系MKN45迁移和侵袭能力的影响

　　　　作者：刘飞，黄培林，黄照权，李楠，徐佳佳，吴鹏

【摘要】 目的： 探讨脆性组氨酸三联体(FHIT)基因转染对人胃癌细胞MKN45迁移和侵袭能力的影响。方法： 将载有人外源性FHIT基因的真核表达质粒pcDNA3.1FHIT，转染至FHIT mRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN45，分别应用Millicell小室细胞迁移实验、Transwell小室侵袭实验检测转染前后MKN45细胞迁移能力和侵袭力的改变。结果： 外源性FHIT基因转染MKN45细胞后， MKN45细胞的迁移能力明显降低(P&<0.05)，但细胞侵袭能力无明显变化(P&>0.05)。结论： 外源性FHIT基因转染致MKN45细胞系的迁移能力明显降低，对MKN45细胞系的侵袭能力无明显影响。

【关键词】 脆性组氨酸三联体;胃癌;基因转染;迁移;侵袭

我国属胃癌高发国家，其发病率与死亡率均居全身恶性肿瘤前列，近年发病率有增高趋势。因此，探讨胃癌发生、发展的分子机制，做到早期预防、早期诊断和早期治疗，寻找新的治疗靶点以及有效的治疗方式成为目前研究的热点。脆性组氨酸三联体( fragile histidine triad， FHIT)基因是Ohta等于1996年从上皮癌细胞系3p14.2区域克隆出的一个候选抑癌基因，在多种肿瘤组织和细胞系中发现FHIT基因有结构及表达异常的报道[13]。作者用外源性FHIT基因转染FHIT阴性表达的MKN45细胞，观察其对胃癌细胞迁移、侵袭的影响，为深入研究FHIT基因在胃癌的发生、发展中的作用机制提供新线索。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　人低分化胃腺癌细胞MKN45由东南大学临床医学院中心实验室馈赠;小鼠成纤维细胞系NIH3T3由东南大学基础医学院病理学与病理生理学系实验室馈赠;培养MKN45细胞用含10%的新生小牛血清、100IU·L-1青霉素和100IU·L-1链霉素的RPMI1640培养液，置于5%CO2、37℃、湿饱和培养箱培养;细胞小室购自美国Millipore公司;RPMI1640培养基购自美国Gibco公司;胎牛血清购自杭州四季青公司;脂质体Lipofectamin2000购自美国Invitrogen公司;其它生化试剂均为分析纯。

　　1.2 方法

　　1.2.1 真核表达质粒pcDNA3.1FHIT的转染 参照说明书，用Lipofectamine2000将真核表达质粒pcDNA3.1FHIT转染至FHIT基因mRNA阴性表达的人胃癌细胞MKN45。转染后采用G418筛选阳性克隆，并且继续培养。用RTPCR法检测FHIT mRNA的表达。

　　1.2.2 Millicell小室细胞迁移实验检测细胞迁移能力变化 (1) 趋化因子的制备：用含10%小牛血清的高糖DMEM培养液，培养NIH3T3细胞至饱和度达80%时弃去原培养液，加入不含血清的RPMI1640培养液3～4ml，培养24　h后收集培养液，2 000 r·min-1离心5～10min，取上清液过滤后-70℃冻存备用。利用饥饿培养的NIH3T3细胞分泌至上清液中的一系列趋化因子，趋化肿瘤细胞向下室运动。 (2) 分别收集空白对照组(MKN45)、pcDNA3.1空质粒转染组(pcDNA3.1MKN45)和pcDNA3.1FHIT转染组(pcDNA3.1FHITMKN45)细胞各1×105个，用含1%FBS的RPMI1640洗涤细胞3次;将小室置入6孔板，在小室内加入1×105个细胞，在6孔板内加入1 600 μl趋化液;常规培养8 h后取出小室。用95%酒精固定细胞，然后行HE染色。轻轻用棉签擦净小室上室面无侵袭性的细胞，在倒置显微镜下放大200倍计数移至微孔膜下层的细胞数目，每个样本随机选择10个视野计数后取均值。实验重复3次。

　　1.2.3 Transwell小室侵袭实验检测细胞侵袭能力变化 (1) 趋化因子的制备同迁移实验。(2) 侵袭小室的制备：细胞小室为一杯状结构，杯底由聚碳酸脂膜构成，膜孔径8 μm。将人工合成的基底膜材料Matrigel胶用同样体积的无血清培养液稀释后，分别取300 μg均匀加于每个小室的膜上，十字摇晃使胶平铺在聚碳酸脂膜上。37 ℃成胶30 min。使用前加无血清培养液于小室内37℃放置20 min，使Matrigel胶重新水化。(3) 接种细胞：细胞分组同迁移实验，将细胞小室放入6孔培养板中，在小室外加入1 500 μl含趋化因子的条件培养液，在小室内加入800 μl细胞悬液(含1×105个细胞)，常规培养24～72 h，分别在24、48、72 h观察。(4) 取出Transwell小室，弃去上室中的培养液，用生理盐水棉签轻擦去Matrigel胶，在倒置显微镜下观察侵袭细胞数。95%乙醇固定15～30 min，HE染色。(5) 在倒置显微镜下放大200倍计数移至微孔膜下层的细胞数目，每个样本随机选择10个视野计数后取均值。实验重复3次，细胞体外侵袭力以侵入滤膜下层的细胞数来判定。

　　1.3 统计学处理

　　实验结果以x±s表示，采用SPSS11.5统计软件进行单因素方差分析，多重比较采用LSD法，P&<0.05为统计学差异显著。统计结果的图形化由Excel 2000绘图程序完成。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒pcDNA3.1FHIT转染MKN45细胞后FHIT基因mRNA的表达情况 pcDNA3.1FHIT转染组细胞有462 bp大小的目的基因条带出现，而pcDNA3.1空质粒转染组和空白 对照组均无目的条带出现(图1)。

　　1.pcDNA3.1FHIT转染组;2.pcDNA3.1空质粒转染组;

　　3.空白对照组;4.100bpDNA Ladder图1 转染后RTPCR产物的琼脂糖凝胶电泳图

　　2.2 FHIT基因转染对MKN 45细胞体外迁移能力的影响 MKN45细胞转染FHIT基因后，通过Millicell小室细胞迁移实验检测细胞迁移能力变化，发现空白对照组穿膜细胞数为(40.4±6.72)个， pcDNA3.1空质粒转染组穿膜细胞数为(39.9±5.02)个，而pcDNA3.1FHIT转染组移至微孔膜下层的细胞数为(20.5±2.42)个，与空白对照组、pcDNA3.1空质粒转染组相比较，体外迁移能力明显降低，有显著性差异(P&<0.05)。见图2、3。

　　2.3 FHIT基因转染对MKN 45细胞侵袭能力的影响

　　Transwell小室侵袭实验结果显示：将5×105个细胞种到Transwell 小室，常规培养24h后仅有少量细胞穿入，而且各组间差别没有统计学意义。接下来我们提高细胞种植的数量，达到10×105个，培养时间也相应延长到48h和72h，穿过膜的细胞数量增多，但是各组之间差别仍无统计学意义。提示FHIT基因的表达水平与MKN45细胞的侵袭力间无明显相关性。见表1、图4～6。

　　3 讨 论

　　FHIT基因是第1个将脆性位点与肿瘤相关联的抑癌基因，该基因脆性位点的断裂或基因缺失与肺癌的发生密切相关[4]。Cortinovis等[5]的回顾性研究表明，FHIT的表达状况可作为一个生物学指标影响着卡铂/吉西他滨治疗非小细胞肺癌的疗效。在宫颈癌患者的血浆和肿瘤组织中，FHIT基因5′端CpG岛甲基化也频繁发生[6]。

　　肿瘤转移是恶性肿瘤的重要生物学特征，包括肿瘤细胞的脱落、迁移、黏附、生长等多阶段的复杂过程，每一阶段均受不同因素影响并由相关基因调控。其中细胞迁移是肿瘤浸润转移的必备条件，肿瘤细胞的迁移能力被认为是癌转移的限速环节。我们的研究结果提示：人胃癌MKN45细胞FHIT基因过表达后，与空白对照组、pcDNA3.1空质粒转染组相比较，体外迁移能力明显降低，有显著性差异(P&<0.05)。FHIT基因可能通过抑制肿瘤细胞的迁移能力来发挥抑癌作用，该基因如何影响细胞运动和迁移的机制是值得深入探讨的问题。肿瘤细胞分泌因子、生长因子、细胞外基质成分以及癌转移靶器官的代谢产物或分泌产物等多种物质可刺激肿瘤细胞的迁移。目前认为，细胞的迁移主要依赖于细胞之间的黏附力以及细胞外基质与细胞骨架之间的作用力。细胞有可能通过调整细胞迁移过程中，作为细胞骨架重要组成部分的微管和肌动蛋白丝结构和(或)动力学变化而影响细胞迁移的发生。Galmarini等[7]在研究p53缺失引起的以微管为靶位化疗药抵抗中发现伴有FHIT表达量的相应改变，表明FHIT可能通过影响微管的组装来发挥其抑制肿瘤的作用。因此，FHIT基因及所表达的蛋白作为微管相关蛋白可能参与影响微管的组装，从而影响迁移的发生，其具体机制有待以后进一步的实验证实。

　　本实验在Transwell小室底层聚碳酸滤膜表面铺备Matrigel，形成类似天然基底膜的结构，能在体外有效地模拟肿瘤细胞的侵袭过程。人工重组基底胶Matrigel含有Ⅳ型胶原、层黏蛋白、巢蛋白(entactin)、硫酸肝素蛋白多糖等成分，与细胞外基质的成分非常相近。肿瘤细胞转移过程中一个必须的步骤是穿越基底膜和侵入细胞外基质，在浸润和转移过程中会遇到一系列的组织屏障，这些屏障由基底膜中基质膜及间质基质所组成，其主要成分包括各型胶原、层黏蛋白、纤维连接蛋白、弹力蛋白等。肿瘤细胞通过膜表面特定受体与基质或基底膜的各种成分相粘连，然后肿瘤细胞可释放蛋白水解酶或激活基质中已存在的酶原，使基质成分降解，最后肿瘤细胞运动充填到被水解的基质的空隙处。目前所知与肿瘤侵袭、转移有关的基质降解酶有蛋白酶类和糖苷酶类两大类，前者主要降解细胞外基质中的蛋白成分，如基质金属蛋白酶(MMP)和尿激酶型纤溶酶原激活物(urokinase plasminogen activator， uPA)，后者主要降解其中的糖蛋白及蛋白聚糖中的多糖链。参与破坏细胞外基质的酶类具有不同程度的特异性，MMP是主要的直接作用者，它通过对细胞外基质中不同成分的降解，在肿瘤侵袭转移中起关键性作用。胃癌研究中发现MMP高表达与胃癌的发生、侵袭和转移有关。本实验上室中的细胞穿越膜上滤膜的下表面，其数量的多少反映了该细胞侵袭能力。侵袭实验结果提示，FHIT基因的表达水平与MKN45细胞的侵袭力改变无明显相关性。

　　肿瘤侵袭和转移是多阶段、多基因参与的过程，相关基因的调节机制异常复杂，涉及多条信号转导途径，阻断其表达或其介导的信号转导通路将有可能为抗肿瘤治疗提供一些较为理想的思路。

参考文献

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　　[5]CORTINOVIS D L，ANDRIANI F，LIVIO A，et al.FHIT and p53 status and response to platinumbased treatment in advanced nonsmall cell lung cancer[J].Curr Cancer Drug Targets，2008，8(5):342348.

　　[6]REN C C，MIAO X H，YANG B，et al.Methylation status of the 5’CpG islands in FH IT gene in the plasma and tissues of cervicalcancer patients[J].Yi Chuan，2006，28(9): 10611066.

　　[7]GALMARINI C M，KAMATH K，VANIERVIORNERY A，et al.Drug resistance associated with loss of p53 involves extensive alterations in microtubule composition and dynamics[J].Br J Cancer，2003，88(11):17931799.