功能近红外光谱对激光诱导间质热疗法治疗肝癌实时在位疗效评估的初步研究

　　　　作者：王栋，周家华，王晋阳，钱志余，陶可涛

【摘要】 目的： 探讨功能近红外光谱(fNIRS)实时在位监测肝癌激光热疗的敏感性、可行性。方法： 体外培养h32肝癌细胞，建立小鼠的肝脏原位移植肿瘤，分不同时间相同功率及不同功率相同时间组分别对肝肿瘤进行激光热疗，同时利用fNIRS监测系统对热疗过程进行实时监测获取相关参数，术后第1天利用7.0T核磁共振(MRI)及病理学检查确定肿瘤毁损范围。结果： 以病理学结果为激光疗效判断标准，在相同时间不同功率组MRI在2.1W未提示损伤，fNIRS监测系统获取的优化散射系数(μs)出现稳定的平台期;相同功率不同时间组MRI一直未提示组织损伤，而μs在150s出现稳定平台期。结论： fNIRS相对目前主要的肿瘤热疗监测手段MRI更加敏感，为开发实时在位激光诱导肿瘤间质热疗精确治疗系统打下基础。

【关键词】 功能近红外光谱;肝脏原位移植肿瘤;激光间质热疗;优化散射系数; 7.0T核磁共振;小鼠

激光诱导肿瘤间质热疗(laser induced interstitial thermotherapy，LIIT)是将激光通过光纤导入到肿瘤组织内部并从加入头表面发出，肿瘤组织吸收激光能量而被加热，由于过热和凝结效应而坏死，它是一种可使局部生物组织凝结坏死的新型肿瘤热疗技术，广泛用于治疗脑、肝脏、乳腺等各部位的肿瘤和良性前列腺增生[12]，但LIIT过程中的实时评估是目前激光治疗的一个技术难题。本实验利用功能近红外光谱(fNIRS)系统对LIIT进行实时监测，与核磁共振(MRI)评估效果相比较，初步探讨fNIRS方法的敏感性及可行性。目前国内外还没有fNIRS应用于LIIT的报道。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物、细胞及仪器

　　清洁级昆明小鼠55只，雌雄对半，4～6周龄，体重18～20g(南京青龙山实验动物繁殖场提供);h32肝细胞肿瘤(北京肿瘤研究所提供);808nm激光发射器(NLFC2.0763 LASER LIGHT，上海恩耐激光厂);fNIRS监测系统(南京航空航天大学生物医学工程系基于Labview7.1平台开发[3]);7.0TMRI(江苏省分子影像与功能影像重点实验室提供，德国Bruker公司生产)。

　　1.2 建立小鼠肝脏原位移植肿瘤模型

　　小鼠肝癌细胞株h32体外常规传代培养，离心后用PBS重悬成浓度达107ml-1的单细胞悬液。75%酒精棉球消毒小鼠皮肤，将2×106～3×106(约0.2ml)的单细胞悬液接种于小鼠右腋窝皮下，建立小鼠皮下移植瘤模型。皮下移植瘤建立3周左右待其长至直径约1.5cm大小时，颈椎脱位法处死皮下荷瘤鼠，消毒皮肤，取下肿瘤，浸入含100U·ml-1青霉素和100μg·ml-1链霉素的1640培养液中，去除中央坏死组织，选取周围健康肿瘤组织剪成大小约1.0mm3的瘤块供原位移植用。1%戊巴比妥钠(10mg·kg-1)腹腔注射麻醉昆明小鼠，75%酒精消毒皮肤，上腹正中行1.0cm的纵行切口，暴露肝脏左叶，无菌眼科剪于左叶横行戳一长约3mm的破口，棉签压迫止血，将瘤块植入肝脏，60可吸收缝线缝合肝脏。适当棉签压迫止血，待止血彻底后60可吸收缝线分层缝合腹部肌层及皮肤，金霉素软膏涂抹切口。

　　1.3 实验动物分组

　　46只小鼠成功建立原位肝脏移植瘤模型，将42只分为相同时间不同功率组，即1.2W150s亚组、2.1W150s亚组、2.4W150s亚组和对照亚组(未行热疗);相同功率不同时间组，即2.1W120s亚组、2.1W150s亚组和2.1W180s亚组;每亚组小鼠7只。

　　1.4 肝肿瘤LIIT及fNIRS监测

　　1%戊巴比妥钠(10mg·kg-1)2/3量腹腔注射麻醉原位移植肝肿瘤小鼠，无菌操作下原切口打开腹腔，暴露肝脏肿瘤。fNIRS系统定标后，小鼠四肢固定，将激光探头、温度探针和fNIRS探头一并插入肿瘤中心并固定之，开启激光发射器，进行激光热疗及fNIRS系统监测，获取相关参数(优化散射系数μs)。完毕后60可吸收缝线分层缝合腹部肌层及皮肤，金霉素软膏涂抹切口。

　　1.5 激光热疗前后7.0T MRI影像对比

　　热疗前1d及热疗后第1天， 1%戊巴比妥钠(10mg·kg-1)1/2量腹腔注射麻醉加异氟烷吸入麻醉原位移植肝肿瘤小鼠后行上腹部核磁扫描(T2像)，获取激光热疗毁损前后肝肿瘤影像。

　　1.6 热疗、MRI扫描后肝肿瘤病理组织学检查

　　在上述激光热疗、7.0TMRI扫描后立即处死小鼠取下肝脏肿瘤标本，行病理组织学检查，以确定肝肿瘤坏死程度及范围。

　　1.7 统计学处理

　　采用SPSS13.0统计软件包，应用单因素方差分析法进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 相同时间不同功率组

　　1.2W150s亚组、2.1W150s亚组、2.4W150s亚组和对照亚组温度变化趋势如图1所示。我们看出激光输出功率越大温度上升越高，但大致都在热疗后60s左右到达平台期，4亚组平台期温度差异有统计学意义，见表1。图1 相同时间不同功率组温度变化趋势图

　　1.2W150s亚组、2.1W150s亚组、2.4W150s亚组和对照亚组热疗中μs趋势如图2。我们看出激光输出功率越大，μs曲线上升越快，到达平台期时间越短且平台越高。1.2W150s亚组140s前后上升至平台期，2.1W150s亚组在120s前后升至平台期，2.4W150s亚组90s前后升至平台期。4亚组平台期μs差异有统计学意义，见表1。表1 相同时间不同功率组温度与优化散射系数比较大致为平台期;4亚组温度比较均取平台期105s点温度值;4亚组优化散射系数均取平台期145s点μs值。4亚组温度采用oneway ANOVA 分析得F=330.381，P&<0.001。4亚组优化散射系数采用oneway ANOVA 分析得F=400.846，P&<0.001 1.2W150s亚组、2.1W150s亚组和2.4W150s亚组激光热疗前后核磁对比，见图3～5。1.2W150s亚组热疗前后核磁影像并无明显差异;2.1W150s亚组热疗后肿瘤中央坏死区增大，和周边组织出现较明显分离线，但并未显示肿瘤周边坏死区;2.4W150s亚组术后肿瘤周边则出现较明显的炎症坏死区。对照亚组术前、术后无变化(未行热疗)。

　　1.2W150s亚组、2.1W150s亚组和2.4W150s亚组激光热疗后病理组织学变化，见图6～8。1.2W150s亚组瘤体周边肿瘤细胞未见明显损伤，但可见少量炎症细胞掺杂;2.1W150s亚组和2.4W150s亚组瘤体周边细胞则出现明显坏死及水肿炎症细胞，且后者比前者炎症更加明显。对照亚组术前、术后肿瘤细胞无损伤(未行热疗)。

　　2.2 相同功率不同时间组

　　2.1W120s亚组、2.1W150s亚组和2.1W180s亚组温度变化趋势见图9。统计学显示3个亚组平台期温度差异无统计学意义，但持续时间不同，见表2。

　　图9 相同功率不同时间组温度变化趋势图

　　2.1W120s亚组、2.1W150s亚组和2.1W180s亚组μs变化趋势见图10。我们看出3个亚组变化趋势基本一致，2.1W120s亚组并未到达平台期，而2.1W150s亚组和2.1W180s亚组均到达平台期，且平台期持续时间不同，两者平台期μs差异无统计学意义，与2.1W120s组差异有统计学意义，见表2。表2 相同功率不同时间组温度与优化散射系数比较

　　1) 75s至150s大致为平台期，取105s点温度值;2) 未升至平台期，取120s点μs值;3) 110s至150s大致为平台期，取145s点μs值。3亚组温度采用oneway ANOVA 分析得F=1.164，P=0.335。3亚组优化散射系数采用oneway ANOVA LSD分析得：2.1W120s亚组和2.1W150s亚组比较P=0.022，2.1W120s亚组和2.1W180s亚组比较P=0.012，2.1W150s亚组和2.1W180s亚组比较P=0.763 2.1W120s亚组、2.1W150s亚组和2.1W180s亚组激光热疗前后核磁影像对比，见图11、图4和图12。得知2.1W120s亚组热疗前后核磁影像无明显差异;2.1W150s亚组热疗后肿瘤中央坏死区增大，和周边组织出现较明显分离线，但并未显示肿瘤周边坏死区;2.1W180s亚组中央坏死区明显增大，瘤体周边亦未显示明显炎症坏死区。

　　2.1W120s亚组、2.1W150s亚组和2.1W180s亚组激光热疗后病理组织学变化，见图13、7、14。2.1W120s亚组瘤体周边肿瘤细胞核浓缩，周边出现少量炎症水肿细胞;2.1W150s亚组和2.1W180s亚组肿瘤周边则出现明显水肿炎症细胞，后者出现更为严重、范围更广的水肿炎症带。

　　3 讨 论

　　1983年LIIT由Bown首创用于治疗实体瘤。2年后，Hashimoto等首先报道了激光治疗肝肿瘤。随着影像技术的发展、激光设备的不断完善和临床应用经验的积累，激光热疗治疗肝癌已获得良好的临床疗效。但由于组织参数不同，以相同功率的激光在相同的时间内对不同组织行热疗，和以不同功率的激光在不同的时间内对相同组织进行热疗的组织毁损范围不尽相同，所以热疗中监测方式对LIIT疗效起重要作用。目前，国内外LIIT监测方式研究主要集中在4个方面。(1) 计算机控温方式：肿瘤中心热电偶测温及反馈的效果很难控制，而且也很难直接和肿瘤的组织参数关联。(2) LIIT术前模拟治疗计划[4]：术前通过MRI检查得到病变的影像学资料，采用数学方法建立热弥散方程，计算出最终毁损范围。这种方法粗糙，不能反映热疗的实际疗效。(3) MRI监测方式[5]：MRI具有良好的软组织对比度、空间分辨率、多轴成像能力以及对温度变化的高度敏感性，是LIIT监测的一种理想方式，但MRI成像和实际热疗过程中组织毁损范围间有一定的延迟。(4) MRI热图[6]：根据光磁流量方法(photon resonance frequency method)，采用2D FLASH(two dimensional fast low angle shot)序列技术在MRI上得到LIIT时组织内部温度变化的图像，再用计算机软件进行色彩编码处理，生成热图(能够反映0.5℃温度的变化)，使操作者能够及时掌握热疗过程中热疗区域的温度变化，但这种方法操作复杂。

　　生物组织是由不同大小、不同成分的细胞和细胞间质组成的，是典型的光的混浊介质，同时存在光的吸收和散射。生物组织凝固的温度范围定义55～95℃ 温度条件下组织蛋白的不可逆热损伤。热凝固或病变的生物组织会产生组织组分和结构的变化[79]，导致组织的光学特性也产生变化。研究表明，热作用下生物组织的光学特性会产生明显的变化，尤其是生物组织对光的散射特性的改变更为显著[1013]。因此，散射系数的变化可作为判断热疗过程中目标组织是否坏死的重要依据。生物组织对于近红外区域的光(700～1200nm)具有相对的透明性，fNIRS技术利用近红外波段光对组织的良好通透性及不同组织分子在该波段的光学性质差异，通过获取吸收系数、散射系数等，达到对组织结构精确定性、精准测量、精细定位。

　　本实验的相同时间不同功率组与对照亚组比较，3个治疗亚组肿瘤中心温度均到达70℃以上，足可使肿瘤中心部位凝固坏死。因为激光功率不同产生肿瘤毁损严重程度不同，从病理切片上我们看出1.2W150s亚组瘤体周边的肿瘤细胞没有明显损伤，2.1W150s亚组和2.4W150s亚组肿瘤周边正常肝组织则受到不同程度的损害。术后MRI1.2W150s亚组和2.1W150s亚组未明确显示肿瘤毁损坏死影像，2.4W150s亚组周围则可见坏死区域。相对MRI，fNIRS所获取μs则出现明显的不同平台期，提示组织受损程度不一，和病理切片结果相对应，即不同的μs值对应不同的组织损伤程度。相同功率不同时间组，肿瘤中心温度同样到达70℃以上，术后病理学检查3个亚组均出现不同程度肿瘤周边损伤。MRI3个亚组均未明确提示肿瘤周边损伤程度及范围。fNIRS所获取μs，2.1W120s亚组因为时间短并未上升至平台期，表示激光热疗并未完全，病理损伤相对2.1W150s亚组和2.1W180s亚组较轻。2.1W150s亚组和2.1W180s亚组μs平台期大致相同，而病理损伤程度不一致，可能因为fNIRS探测系统只能覆盖一定范围，随着激光热疗时间的延长，组织毁损范围超出了fNIRS探测系统的覆盖范围，故此时μs不能反映实际毁损范围内的组织损伤情况。

　　本实验结果表明对于激光热疗的术中监测，fNIRS探测系统所获取的μs变化比术后第1天MRI反映的热疗组织损伤更加及时，实用性亦很强。因为不同个体、不同组织、不同激光所产生的μs存在很大的差异，μs和组织损伤严重程度的确切关系目前不能量化，所以有待进一步试验研究。

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