丹参酮对血管性痴呆模型大鼠学习记忆障碍的改善作用

【摘要】 目的： 研究丹参酮对拟人类血管性痴呆(VD)模型大鼠学习记忆功能障碍的改善作用。方法： 采用改良的大脑中动脉栓塞(MCAO)致局灶性脑缺血(3 h)和再灌注(30min)法，建立VD样学习记忆障碍的大鼠模型。实验动物随机分成VD模型组、丹参酮治疗组、假造模对照组和正常对照组等4组。采用定位航行和空间探索试验测定大鼠的空间学习记忆功能。结果： (1) VD大鼠定位航行试验的逃避潜伏期明显延长;空间探索试验的逃避潜伏期延长更明显，而逃避频率降低，与两对照组比较有显著性差异(P&<0.01)。(2) 丹参酮治疗后，VD大鼠定位航行试验的逃避潜伏期缩短;空间探索试验的逃避潜伏期缩短更明显，而其安全逃避频率有明显提高。结论： (1) 本研究制成的VD样学习记忆障碍的动物模型具有较好仿真人类VD的特点;水迷宫试验能较真实地反映动物学习记忆功能。(2) 丹参酮对VD样大鼠的学习记忆功能障碍具有一定的改善作用。

【关键词】 丹参酮; 血管性痴呆; 动物模型; 大脑中动脉栓塞; 水迷宫试验; 学习记忆; 大鼠

血管性痴呆(vascular dementia， VD)是由各种脑血管疾病引起的脑功能障碍，是一种获得性智能损害综合征[1]，为老年期痴呆的主要类型之一，其主要临床表现以记忆、认知功能缺损为主，可伴有言语、运动、视空间和人格障碍。VD是唯一的一种可以预防的痴呆类型，早期积极防治具有可逆性。在导致VD的多种脑血管疾病中，以缺血性脑血管疾病为最多见。脑缺血再灌注后直接或间接损伤海马等边缘脑区神经细胞，机体会启动多种机制调控学习、记忆的功能活动。

　　有报道，丹参酮ⅡA和ⅡB能缩小小鼠短暂的(急性)局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用[2]，还能改善缺血再灌注损伤小鼠和东莨菪碱(抗胆碱药)诱发的空间行为缺陷小鼠的学习记忆障碍[3]。因此，对VD的脑损伤机制及其防治已成为世界医学领域联合攻关、重点研究的项目。本研究采用改良的大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)[45]致局灶性脑缺血再灌注法诱发VD大鼠模型，同时观察丹参酮对其的治疗作用，为探索人类VD的发病机制及其防治新措施提供实验依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 实验动物与分组

　　选用健康清洁二级SD雄性大鼠60只，体重(220±20)g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供。动物于专用实验室内分笼饲养，室温(22±2)℃，自由摄食和饮水。

　　将大鼠随机分为4组：VD模型组20只，丹参酮治疗组20只，假造模对照组10只和正常对照组10只。

　　1.2 主要试剂及仪器

　　丹参酮，华中科技大学同济医学院临床药理学教研室惠赠;仿Morris水迷宫装置，华中科技大学同济医学院神经生物学系研制。

　　1.3 造模方法

　　根据Zealonga等[45]的MCAO法，稍加改进制作VD大鼠模型。大鼠造模前禁食(不禁水)12 h，以10%水合氯醛(0.35 g·kg-1)腹腔注射麻醉，常规皮肤消毒后解剖分离右侧颈总动脉、颈内动脉及颈外动脉，并挂上备用结扎线，电凝颈外动脉入脑分支和结扎其主干，分离颈内动脉主干至翼腭动脉，并在其起始部位放置一动脉夹。先将颈总动脉用动脉夹夹闭，再在颈外动脉残端开0.2 mm切口，由切口处插入圆锥头的尼龙线(直径0.25 mm)，于入口处结扎尼龙线，然后松开颈内动脉的动脉夹，轻推尼龙线沿颈内动脉入颅(深度约为18 mm)，如此实现MCAO致脑局灶性缺血。随后于脑缺血后3 h轻拉出外留尼龙线尾至结扎口处，如此实现大脑中动脉缺血再灌注(供血30min)造模。大鼠放回鼠笼中，保温饲养。

　　假造模对照组大鼠仅解剖分离上述动脉，不再作插线栓、结扎等处理。正常对照组大鼠不作任何处理。

　　1.4 丹参酮治疗

　　造模后丹参酮治疗组大鼠立即胃饲丹参酮，丹参酮按50 mg·kg-1·d-1溶于5 ml玉米油中灌胃[6]。两对照组及VD模型组仅以等量玉米油灌胃。各连续14　d，然后进行有关指标的检测。

　　1.5 造模动物神经功能评定

　　按照Zealonga等[4]5级评分法，在造模大鼠清醒后立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常0分，对侧肢体屈曲1分，拖鼠尾后拉时对侧肢体无力2分，拖鼠尾后拉时向对侧转圈3分，自发向对侧转圈或倾倒4分。选取评分为2分及以上者入围实验。

　　1.6 动物学习记忆功能的测试

　　对每组实验大鼠分别进行水迷宫学习记忆行为学测试[78]，选择学习记忆行为“正常”的大鼠入围实验;大鼠MCAO再灌注后立即做水迷宫试验鉴定动物模型。

　　1.6.1 水迷宫的组成 仿Morris水迷宫装置[7]由圆形有机玻璃水池、平台、自动记录系统、供水系统4部分组成。水池直径130 cm、高50 cm，水深30 cm，水温(24±1)℃。池壁装有4个等距离入水点作为试验起始点，水池被等分成4个象限，其中1个象限正中放置1个玻璃平台，直径12 cm，高29 cm。水迷宫上方装有摄像机并与计算机连接，实时动态记录大鼠游泳轨迹。

　　1.6.2 水迷宫测试 检测大鼠空间学习记忆功能，包括定位航行试验和空间探索试验，共进行6 d。(1) 定位航行试验，每天2次，历时5 d，跟踪记录大鼠游泳轨迹。将大鼠面向池壁，分别从4个入水点下水，记录在2 min内寻找到平台的时间(称逃避潜伏期)，如果在2 min以上未找到平台，潜伏期记为120 s。训练时实验者可以帮助大鼠找到平台，并停留10 s。试验完后将大鼠放回鼠笼中。(2) 空间探索试验，定位航行试验完成后(第6天)撤去平台，将大鼠由任一入水点下水，记录大鼠的游泳轨迹和时间，并测定在2 min内第1次跨越原平台象限游泳的时间及频率[次数·(2min)-1]。

　　1.7 统计学处理

　　所有的数据以x±s表示，采用SPSS10.0进行方差分析和多组间均数比较，P&<0.05为差异有显著意义。

　　2 结 果

　　本实验全部入围实验大鼠(造模前)无明显学习、记忆功能异常;VD模型组大鼠出现2～3分级神经功能障碍，无瘫痪或死亡动物。

　　2.1 定位航行试验

　　各组大鼠在5 d的水迷宫定位航行训练中，寻找平台的平均逃避潜伏期有明显的变化，一般为随着训练次数的增加，其潜伏期均有不同程度的缩短。正常对照组、假造模对照组、丹参酮治疗组在训练后第 3天趋于平稳，而VD模型组大鼠在训练后第4天起趋于平稳(即VD模型组大鼠的行为症状改善较丹参酮治疗组时间推延)。训练后3 d各组平均潜伏期见表1。VD模型组大鼠潜伏期明显长于假造模对照组和正常对照组大鼠(P&<0.01)，丹参酮治疗组大鼠潜伏期明显短于VD模型组(P&<0.01)。表1 各组大鼠定位航行试验的逃避潜伏期比较

　　2.2 空间探索试验

　　大鼠在经5 d定位航行训练后移除平台，各组大鼠依记忆寻找原平台象限(游泳轨迹)。正常对照组、假造模对照组和丹参酮治疗组大鼠的游泳轨迹基本上集中在平台象限，而VD模型组大鼠的游泳轨迹呈随机紊乱分布，首次跨越原平台时间(逃避潜伏期)明显延长，跨越原平台频率明显少于两对照组大鼠。各组大鼠跨越平台的逃避潜伏期和频率见表2。表2 各组大鼠空间探索试验跨越平台逃避潜伏期和频率比较

　　3 讨 论

　　丹参酮治疗组应用丹参酮灌胃后，大鼠在水迷宫中的空间认知能力较VD模型组有显著提高，即与VD模型组比较大鼠定位航行的逃避潜伏期明显缩短[20.06s·(2 min)-1vs28.75s·(2 min)-1，P&<0.01];而跨越平台逃避频率明显高于VD模型组[6.58次·(2min)-1vs2.45 次·(2 min)-1，P&<0.01]，稍低于两对照组。由此表明，丹参酮对大鼠空间学习记忆能力有明显改善作用。

　　丹参酮是从唇形科丹参根部(Salvia miltiorrhiza Bge)提纯的主要功能成分，为多种同功异质体化合物的一种混合剂，分为丹参酮ⅡA、ⅡB等成分[9]。本实验所用丹参酮混合剂为华中科技大学同济医学院药理学系与北京医学科学院中药研究所协作科研成果[10]。经药效学试验表明，丹参酮的药理学作用主要为降低血小板聚集率和血栓指数、降血脂、抑制细胞黏附与表达等。有文献报道丹参酮对Aβ140诱发阿尔茨海默病模型大鼠的学习记忆障碍具有一定的治疗作用[6]，其作用机制可能是通过抑制海马内诱导型一氧化氮合酶的表达降低NO的生成量，从而起到对胆碱能神经系统的保护作用[10]。VD是老年期痴呆的主要类型之一，各种方法治疗VD无疑也将针对其发病机制。脑缺血的病理学机制主要有自由基损伤、Ca2+超载、兴奋性氨基酸的神经毒性作用、血管活性物质的过度释放、凋亡基因的表达等，这些细胞内外信号的改变可能从不同途径影响学习记忆相关的通路。丹参酮可以有效改善VD学习记忆能力，其作用机制可能包括降低NO/Glu的神经毒性，即通过抑制NO、cGMP致GluNMDA受体细胞内信号转导通路抵御缺血缺氧脑损伤，激活cAMPPKA学习记忆信号通路，促进学习记忆能力的改善。本研究对丹参酮治疗老年痴呆提供了较重要的实验依据，但有关丹参酮改善VD学习记忆的作用及其机制尚待进一步研究。

参考文献

　[1]茹立强，王才源，殷光甫.神经科学基础[M].北京：清华大学出版社，2004：339348.

　　[2]LAM B Y，LO A C，SUN X，et al.Neuroprotective effects of tanshinones in transient focal cerebral ischemia in mice[J].Phytomedicine，2003，10(4):286291.

　　[3]LIU X J，WU W T.Effects of ligustrazine tanshinone ⅡA，ubiquinone，and idebenone on mouse water maze performance [J].Acta Pharmacol Sin，1999，20(11):987990.

　　[4]ZEALONGA E Z，WEINSTEIN P P，CARLSON S，et al.Reversible middle cerebral artery occlusion without cranicetomy in rats[J].Stroke，1989，20(1):8491.

　　[5]NAGASAMA H，KOGURE K.Correlation between cerebral blood flow and histologic changes in a new rat model of middle cerebral artery occlusion[J].Stroke，1989，20(8):10371043.

　　[6]李龙宜，茹立强.丹参酮对海马内注射β淀粉样肽后大鼠学习记忆障碍的影响[J].中国老年学杂志，2003，23(5)：294297.

　　[7]叶翠飞，张丽，艾厚喜，等.两种水迷宫实验对拟痴呆模型学习记忆功能测试的比较[J].中国行为医学科学杂志，2004，13(3)：256261.

　　[8]MORRIS R.Development of a water maze procedure for studying spatial learning in the rat[J].Neurosci Methods，1984，11(1):4760.

　　[9]JI X Y，TAN B K H，ZHU Y Z. Salvia miltiorrhiza and ischemic diseases[J].Acta Pharmacol Sin，2000，21(12):10891094.

　　[10]LI L X ，DAI J P，RU L Q，et al.Effects of tanshinone on neuropathological changes induced by amyloid βpeptide140 injection in rat hippocampus[J].Acta Pharmacol Sin，2004，25(7):861868