结核杆菌抗原85A与GMCSF诱发抗鼠黑色素瘤效应研究

　　　　作者：刘春生，吴昀，窦骏，文萍，赵枫姝，唐权，李金龙，王亚琴

【摘要】 目的：用结核杆菌抗原85A(Ag85A)和细胞因子GMCSF，作为异种抗原及免疫增强剂，研究其在鼠体内能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答。方法：用分子生物学法构建重组质粒pRSCAg85A/GMCSF，通过细胞转染获得稳定表达Ag85A和GMCSF的B16黑色素瘤细胞。48只C57BL/6小鼠随机均分为B16细胞组、B16pRSC细胞组、B16Ag85A细胞组和B16Ag85A/GMCSF细胞组，分别将上述不同B16细胞经背部皮下接种小鼠。通过观察其致瘤性的强弱、荷瘤鼠生存时间、鼠血清IFNγ水平以及CTL、NK细胞杀伤活性，分析Ag85A和GMCSF在抗肿瘤免疫效应中作用。结果：B16Ag85A/GMCSF细胞组小鼠肿瘤生长明显受到抑制，生存时间较对照组平均延长40%，血清IFNγ分泌较对照组高1倍，CTL、NK细胞杀伤活性与其他各组相比也有较大的提高。结论：接种稳定表达Ag85A和GMCSF的B16细胞能降低对小鼠的致瘤性，诱导有效的抗肿瘤效应。

【关键词】 结核杆菌抗原85A; 粒细胞巨噬细胞集落刺激因子; 致瘤性; 免疫佐剂

　　[Abstract] Objective: To study antimelanoma effect in mice injected with melanoma cells expressing Mycobacterium tuberculosis antigen 85A(Ag85A) and GMCSF as heterogeneity antigen and immunoadjuvants. Methods: The recombinant pRSCAg85A/GMCSF was constructed by the molecular biological technology and was transfected into the melanoma B16 cells and the transcription of Ag85A and GMCSF in B16 cells was respectively detected by RTPCR. The different genemodified B16 cells were injected into C57BL/6 mice and the tumorigenicity was analyzed by measuring the size of tumor and observing the survival of tumorbearing mice. Meanwhile， the antitumor immune response induced by the Ag85A and GMCSF was evaluated by detecting the activities of CTL and NK cells， and serum cytokine level respectively. Results: Mice injected with B16 cells transfected with the recombinant pRSCAg85A/GMCSF could survive longer than the other mice. Compared with the control group， the level of IFNγ in the serum and the activities of CTL and NK cells were obviously increased and the difference was statistically significant. Conclusion: B16 cells transfected with the recombinant pRSCAg85A/GMCSF could reduce the tumorigenicity and effectively induce the antitumor effect in mouse model.

　　[Key words] Mycobacterium tuberculosis antigen 85A; granulocyte macrophage colony stimulating factor; tumorigenicity; immunoadjuvants

　　结核杆菌抗原85A(Ag85A)是结核分枝杆菌和卡介苗(BCG)主要分泌蛋白Ag85复合物中的组分之一。Ag85复合物是一相对分子质量为30 000～32 000的蛋白质家族，主要由Ag85A、Ag85B、Ag85C 3种蛋白质组成，它们具有海藻糖双霉菌酸酯(即索状因子)生物发生所需的分枝酰转移酶活性，是分枝杆菌细胞壁的主要成分。其中Ag85A可能是细菌生长和维持毒力的最重要成分[1-2]。以Ag85A为基础制备的DNA疫苗在动物实验中显示可上调机体的细胞免疫应答[3]。因此，在抗肿瘤研究中，Ag85A可能作为Th1细胞的激活剂与异种抗原发挥抗肿瘤作用。

　　粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GMCSF)不仅能刺激和活化专业抗原递呈细胞(APC)，提高机体特异性的抗肿瘤免疫应答，还能促进粒细胞、巨噬细胞增殖、分化与功能成熟;增强NK细胞活性，发挥非特异性抗肿瘤作用[4-9]。本研究利用Ag85A作为异种抗原及免疫增强剂，探讨其能否有效地诱导抗黑色素瘤免疫应答;并结合细胞因子GMCSF，探讨Ag85A与GMCSF能否在体内产生协同的抗黑素瘤免疫应答及其相关机制，并为今后肿瘤疫苗研制奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　细胞与培养基(B16F10细胞)，质粒和菌株(真核细胞表达质粒pRSC、pIRESAg85A、pRSCGMCSF、宿主菌E. coli DH5α)，转染和鉴定试剂(脂质体、G418)，C57BL/6小鼠，小鼠IFNγ ELISA检测试剂盒。

　　1.2 方法

　　1.2.1 引物设计与合成 根据GenBank Ag85A(序列号：M27016 X53898)和质粒pRSC特点，按照酶切位点对侧翼序列的要求设计。上游引物:5′ATTAGCGGCCGCATGCAGCTTGTTGAC3′，含酶切位点NotⅠ和起始密码ATG;下游引物：5′ATATGCGGCCGCCTAGATGTTGTGTCTGT3′，含酶切位点NotⅠ并在ORF终止密码子之后，Ag85A含信号肽序列。

　　1.2.2 Ag85A 编码基因的扩增 以pIRESAg85A为模板，进行Ag85A基因的扩增。

　　1.2.3 质粒pRSCAg85A/GMCSF构建及鉴定 参照文献[10]。

　　1.2.4 重组质粒、空质粒转染B16细胞及G418筛选 参照文献[11]。

　　1.2.5 Ag85A与GMCSF基因稳定表达鉴定 参照文献[12]。

　　1.2.6 荷瘤小鼠模型的建立 将48只C57BL/6小鼠随机分为4组，即B16细胞组(对照组1)、B16pRSC细胞组(对照组2)、B16Ag85A细胞组(实验组1)和B16Ag85A/GMCSF细胞组(实验组2)，每组12只，于背部皮下接种B16细胞(2×105只-1)。12 d后，小鼠背部皮下即可长出肿瘤结节。观察并测量小鼠背部皮下肿瘤的体积、记录荷瘤小鼠生存的时间、血清IFN-γ水平。用游标卡尺测量肿瘤的长径(a)和宽径(b)(cm)，荷瘤体积(cm3)的计算公式为:V=a×b2/2，参照文献[13]。

　　1.2.7 CTL及NK细胞杀伤活性的检测 参照文献[14]。

　　2 结 果

　　2.1 重组质粒pRSCAg85A/GMCSF的测序鉴定

　　Ag85A与GMCSF基因序列与GenBank Ag85A(M27016X53898)和GMCSF(序列号：AY428162或gi:37964403)序列完全一致(资料未显示)。重组质粒pRSCAg85A/GMCSF转染B16细胞转录水平鉴定：从B16Ag85A/GMCSF、B16Ag85A、B16pRSC和B16细胞抽提的总RNA模板中，分别以内对照磷酸3甘油醛脱氢酶(glyceraldehydes3phosphate dehydrogenase，GAPDH)、GMCSF特异性引物和Ag85A特异性引物扩增GAPDH、GMCSF及Ag85A基因，结果这4组细胞抽提物均扩增出GAPDH，但只有B16Ag85A/GMCSF细胞抽提物中能成功扩增GMCSF及Ag85A目的片段，表明有GMCSF及Ag85A基因的转录表达，琼脂糖凝胶结果见图1、2。1～3. 依次为B16、B16GMCSF、B16pRSC RTPCR产物; 4. B16GMCSFAg85A、B16Ag85A RTPCR产物; 5. DNA Marker

　　2.2 小鼠背部皮下肿瘤体积的观测

　　小鼠背部皮下分别接种2×105 B16细胞(对照1组)、B16/pRSC细胞(对照2组)和B16Ag85A细胞(实验组1)、B16Ag85A/GMCSF(实验组2)。采用每两天1次测量肿块大小进行动态观察的方法，来评估肿块的生长状态。

　　实验结果显示，接种B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞的小鼠背部皮下肿瘤体积明显小于对照组，其生长状况也优于对照组。与接种非Ag85A基因修饰的对照组比较，接种Ag85A基因修饰细胞的荷瘤小鼠肿瘤的生长明显被抑制，差异具有统计学意义(P&<0.05)，见表1、图3。表1 Ag85A与GMCSF对小鼠黑色素瘤的治疗作用

　　2.3 荷瘤小鼠生存时间的观察

　　4组荷瘤小鼠的平均生存时间依次为30.9、29.5、41.3、43.3 d。两个对照组荷瘤小鼠的生存时间无统计学意义，而与实验组荷瘤小鼠的生存时间相比较，差异具有统计学意义(P&<0.05，表1、图4)。

　　2.4 血清IFNγ水平的检测

　　ELISA法检测表明，接种不同瘤细胞后，12 d内4组小鼠血清IFNγ的水平分别从16.7、12.4、15.9、13.4 pg·ml-1上升到19.9、22.1、26.8、28.3 pg·ml-1，随后B16组、B16pRSC组的小鼠血清IFNγ水平出现缓慢增长趋势，至18.8、23.7 pg·ml-1表现出下降的态势，而B16Ag85A组、B16Ag85A/GMCSF组分别上升到40.8、45.2 pg·ml-1。实验组与对照组比较，组间差异有统计学意义(P&<0.05，图5)。

　　2.5 CTL及NK细胞杀伤活性的检测

　　取各组荷瘤鼠的脾细胞，分别以B16F10、YAC1作为靶细胞，通过7AAD染色法流式细胞术检测CTL、NK细胞杀伤活性，结果见图6。

　　A、B. 分别是荷瘤鼠脾CTL和NK细胞毒活性; 1～4. 依次为B16、B16pRSC、B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞组。3、4组相对1、2组CTL和NK细胞毒活性显著增强(P&<0.001); 3、4组间差异也存在统计学意义(P&<0.05)

　　3 讨 论

　　结合目前基因治疗发展的趋势和实际工作条件，我们选择在抗肿瘤领域已经得到广泛应用的GMCSF与BCG有效成分Ag85A基因作为候选基因进行联合免疫，并使用共表达载体将细胞因子GMCSF基因与Ag85A基因构建于同一个真核表达载体上，所表达的2个外源基因均为游离蛋白，两者不会相互影响对方的空间构型和覆盖抗原决定簇[15-16]，使两者在1个细胞中更好地发挥协同免疫作用，有效地打破肿瘤局部微环境的免疫抑制作用。

　　为了得到稳定表达的细胞株，将测序证实构建正确的pRSCAg85A/GMCSF转染的B16细胞进行G418的筛选，采用的质量浓度为800 mg·L-1。经过筛选，得到了稳定共表达Ag85A与GMCSF的细胞株B16Ag85A/GMCSF，同时还分别得到了单独表达GMCSF、Ag85A的细胞株B16GMCSF、B16Ag85A。我们通过RTPCR从B16Ag85A/GMCSF细胞抽提物的总RNA模板中同时扩增到GMCSF与Ag85A目的片段，这说明在B16Ag85A/GMCSF中存在GMCSF与Ag85A mRNA的共表达。

　　对肿瘤细胞疫苗疗效的评估包括对荷瘤鼠肿块生长状态和荷瘤鼠机体免疫功能的检测等[17]。实验结果显示，接种B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞的小鼠背部皮下肿瘤体积明显小于两个对照组，肿瘤的生长明显被抑制，其生长状况也优于两个对照组;B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞组小鼠同B16、B16/pRSC细胞组小鼠相比，生存期延长率分别达到33.7%、40.1%;各组小鼠血清IFNγ的水平在12 d内均有一定提高，但随后B16、B16/pRSC细胞组小鼠血清IFNγ水平出现缓慢增长趋势，至24 d表现出下降的态势，而B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞组小鼠血清IFNγ水平继续升高，分别上升到40.8、45.2 pg·ml-1。同时本次研究发现试验组小鼠的脾CTL、NK细胞杀伤活性显著高于对照组。B16Ag85A、B16Ag85A/GMCSF细胞组间也有明显差异。

　　Ag85A既可作为异种抗原，激活小鼠体内免疫细胞，调节肿瘤微环境中免疫细胞，激发特异性免疫应答;又可作为免疫增强剂，增强小鼠的非特异性免疫应答，在抗黑色素瘤辅助治疗中发挥重要作用[18]。通过该研究，我们认为细胞因子GMCSF能够有效地提高Ag85A抗肿瘤免疫调节作用，促进Ag85A产生更明显的免疫反应，两者之间具有免疫协同效应。本研究结果为进一步在动物体内进行抗肿瘤效应实验研究，提供了新的方法。该研究为结核杆菌Ag85A和GMCSF作为免疫佐剂在体内诱导抗瘤效应及肿瘤疫苗研究奠定了实验基础。

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