TNFα对小鼠肾上腺皮质细胞系Y1增殖、凋亡的影响

　　　　　　作者：方媛　，夏海鸣　，孙佳　，黄培林

【摘要】 目的:探讨肿瘤坏死因子α(TNFα)对小鼠肾上腺皮质细胞系Y1增殖、凋亡的影响。方法:不同浓度、不同作用时间的TNFα处理小鼠肾上腺皮质细胞系Y1;MTT法检测细胞的增殖;台盼蓝拒染法检测细胞增殖抑制;流式细胞仪检测细胞的凋亡水平;分光光度法检测细胞caspase8/3的变化。结果:不同浓度的TNFα处理Y1细胞不同时间后，细胞的增殖能力明显下降(P&<0.05);细胞凋亡水平明显提高(P&<0.05);细胞caspase8/3水平明显升高(P&<0.05)。结论:TNFα可抑制Y1细胞增殖，并通过提高caspase8/3的活性而诱导及促进细胞凋亡。

【关键词】 肿瘤坏死因子α; Y1细胞; 增殖; 凋亡; caspase8; caspase3

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of tumor necrosis factor α(TNFα) on proliferation and apoptosis of mouse adrenal cortex cell lines Y1. Methods: The mouse adrenal cortex cell line Y1 was treated with TNFα at different concentrations during different duration. The cells proliferation was tested by MTT assay and cytostasis was detectd by Trypan Blue Coloring Method. Flow cytometry was used to observe the cells apoptosis level. The changes of Caspase8/3 of the cells were detected by spectrophotometry. Results: After being treated with TNFα of different concentration during different duration， reproductive activities of Y1 cells were significantly inhibited(P&<0.05); the apoptosis and Caspase8/3 levels of Y1 cells were both remarkably highered(P&<0.05). Conclusion: TNFα can inhibit proliferation of Y1 cells， and induce and promote the apoptosis by increasing caspase8/3 activity.

　　[Key words] tumor necrosis factor α; Y1 cells; proliferation; apoptosis; caspase8; caspase3

　　肿瘤坏死因子α(TNFα)是一种主要由单核巨噬细胞产生的单核因子，具有选择性地杀伤某些哺乳类动物的肿瘤细胞，并通过半胱天冬酶级联介导和活化激活蛋白1、核因子κB两个转录因子的通路诱导其凋亡。近些年来，TNFα对内分泌细胞的作用逐渐受到关注。2007年，Mikhaylova等[1]研究发现，TNFα可以降低人类肾上腺皮质NCIh395R细胞的增殖活性并诱导其凋亡。但是，它诱导内分泌细胞凋亡的机制目前尚不明确，而且不同细胞对TNFα的敏感性亦不相同。本研究旨在探讨TNFα对小鼠肾上腺皮质细胞增殖、细胞凋亡及其可能机制，为今后深入了解TNFα介导的炎症反应对小鼠肾上腺皮质功能的影响提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　小鼠肾上腺皮质细胞系Y1(中国科学院上海细胞生物研究所);肿瘤坏死因子α(TNFα)(Peprotech公司);F12培养基(GIBCO公司)、胎牛血清(杭州四季青公司)、MTT(GIBCO公司)、DMSO(Sigma公司);台盼蓝染液(南京生兴生物技术有限公司);Annexin VFITC及PI细胞凋亡检测试剂盒(南京凯基生物公司);caspase8/3分光光度法检测试剂盒(南京凯基生物公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 细胞培养 小鼠肾上腺皮质细胞系Y1用含10%的胎牛血清、1.176 g NaHCO3及100 IU·L-1青链霉素的F12培养液，在体积分数为0.05的CO2、37 ℃、湿饱和的条件下培养。细胞生长至80%融合时，用0.25%的混合胰酶消化后按1瓶传至2～3瓶进行传代，取其对数生长期细胞进行实验。

　　1.2.2 MTT比色法检测细胞增殖 将处于对数生长期Y1细胞用0.25%的胰酶消化，进行细胞计数，调整浓度为1×105 ml-1，将细胞均匀接种96孔培养板，每孔200 μl，每孔细胞约为2×104个。过夜贴壁后，更换无血清培养液，培养24 h后实验组分别加入100、200、250 U·ml-1的TNFα 200 μl。阴性对照组加入等体积的F12培养液。细胞在体积分数为0.05的CO2、37 ℃条件中分别培养6、12、24、48 h后，加入5 mg·ml-1 MTT 20 μl，37 ℃继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃培养上清，每孔加入150 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使结晶充分溶解。在酶标仪上测定波长为490 nm的OD值，最后以抑制率为纵坐标，以时间为横坐标，绘制生长曲线。实验重复3次。药物对细胞增殖的抑制率(IR)=[1-(用药组测定的平均OD值/对照孔测定的平均OD值)]×100%。

　　1.2.3 台盼蓝拒染法检测细胞数目 取对数生长期的Y1细胞，调整细胞浓度为1.0×105～2.0×105 ml-1，接种于6孔板，每孔1 ml，用药组分别加入100、200、250 U·ml-1的TNFα 1 ml，每组设3个平行孔，并设阴性对照组。细胞加药后在体积分数为0.05的CO2、37 ℃条件中分别培养6、12、24、48 h后，然后按1∶10加入0.4%的台盼蓝，染色2～3 min，在光学显微镜下行活细胞计数。药物对细胞增殖的抑制率(IR)=[1-(用药组平均活细胞数/对照组平均活细胞数)]×100%计算。实验重复3次。

　　1.2.4 流式细胞仪(FCM)检测细胞凋亡 分别收集经100、200、250 U·ml-1的TNFα处理并培养6、12、24、48 h后的实验组细胞及等量F12培养液培养的阴性对照组细胞，常规胰酶消化后制成单细胞悬液，离心弃上清液，再经预冷的PBS洗2次，按AnnexinV /FITC及PI试剂盒提供方法依次加入结合缓冲液、AnnexinV/FITC及PI，室温避光15 min后上机测试，采用FACS Calibur流式细胞仪对样品进行检测，每次计细胞数5 000个，激发波长488 nm，分析软件CellQuest计算凋亡率。实验重复3次。

　　1.2.5 caspase8/3 活性检测 用分光光度法检测caspase8/3的活性。分别收集经100、200、250 U·ml-1 TNFα处理并培养6、12、24、48 h后的实验组细胞及等量F12培养液培养的阴性对照组细胞，进行细胞计数，调整浓度为1×105 ml-1，将细胞均匀接种96孔培养板，每孔100 μl，每孔细胞约为1×104个。阴性对照组加入等体积的F12培养液。用振荡器振荡30 s使混合物混合均匀，在37 ℃继续避光孵育4 h。在酶标仪上测定波长为405 nm的OD值，实验重复3次。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 11.0软件进行数据处理，实验结果用±s表示，多组资料比较行oneway ANOVA分析，组间比较行oneway ANOVA检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 TNFα抑制Y1细胞的增殖

　　100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48 h后均可抑制细胞增殖。与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)。细胞增殖抑制率随TNTα作用时间和剂量增加而呈现递增的趋势(图1)。提示TNFα能够明显抑制Y1细胞的增殖，并且这种抑制性呈时间剂量依赖性。图1 不同时间和浓度TNFα对Y1细胞增殖抑制率的影响

　　2.2 台盼蓝拒染法检测Y1细胞增殖抑制

　　100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48h后均可抑制细胞增殖。与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)。细胞增殖抑制率随时间和剂量的增加呈现增高的趋势(表1)，提示TNFα能够明显抑制Y1细胞的增殖，并且这种抑制性呈时间剂量依赖性。

　　2.3 TNFα促进Y1细胞的凋亡

　　100 U·ml-1的TNFα作用细胞48 h凋亡率为9.2%，与阴性对照组(凋亡率为7.7%)比较，差异无统计学意义(P&>0.05);而200、250 U·ml-1的TNFα作用细胞48 h后凋亡率分别为16.6%、22.3%，与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)(图2)。提示TNFα能够明显促进Y1细胞的凋亡，并呈剂量依赖性。表1 TNFα不同作用时间和作用浓度后Y1细胞增殖抑制率变化各组内比较，a P&<0.05;与相应时点阴性对照组比较，b P&<0.05

　　2.4 TNFα激活Y1细胞caspase8/3的活性

　　100、200、250 U·ml-1的TNFα作用于细胞6、12、24、48 h后均可使caspase8和caspase3活性增强(P&<0.05)(表2)。与阴性对照组比较，差异具有统计学意义(P&<0.05)。且caspase8和caspase3的活性随时间和剂量的增加有呈现增高的趋势(表2)。结果显示，TNFα能够激活caspase8和caspase3的活性，并呈时间剂量依赖性。提示TNFα可能通过促进caspase8/3活性诱导Y1细胞的凋亡。表2 不同浓度的TNFα作用不同时间后Y1细胞caspase8和caspase3的变化

　　3 讨 论

　　TNFα是一种多功能的细胞因子，通过受体介导而作用于靶细胞，对肿瘤细胞具有细胞毒性、免疫调控作用[2]。不同细胞对TNFα的敏感性不同。本研究应用MTT法和台盼蓝拒染法测定了TNFα对小鼠肾上腺皮质细胞的增殖抑制作用，研究显示，在不同浓度的TNFα作用细胞不同时间后，细胞的增殖抑制率受到明显影响，并且这种抑制性呈时间剂量依赖性。

　　TNFα参与到细胞因子介导的免疫系统和下丘脑垂体肾上腺轴之间的交流中[3]，TNFα的受体在下丘脑和垂体前叶表达。TNFα是一种在发生组织损伤、感染、炎症和许多其他刺激时大部分由活化的单核细胞和巨噬细胞合成的炎症细胞因子，可激活两个主要的信号通路：半胱天冬酶级联导致的凋亡和另一个导致2种主要转录因子(激活蛋白1和核因子κB)活化的通路，它依次诱导参与炎症反应和凋亡抑制的基因的活化[4-5]。TNFα通过2个受体介导它的作用(TNFR1和TNFR2)。在TNFR1未与TNF结合之前，TNFR1的胞内区与死亡结构域沉默子(silencer of death doman，SODD)结合，抑制了TNFR1的死亡结构域(death domain，DD)与TNFR1等接头分子的结合，阻断了TNFR1活化所致的细胞凋亡;当三聚体TNF与TNFR1的胞外区结合，引起TNFR1的三聚化，胞内区的SODD被释放，TNFR1胞内区的死亡结构域与TRADD死亡区域结合蛋白(TRADDassociated death domain protein，TRADD)相结合，产生2种不同的诱导调节机制：(1)通过TNFR1TRADDFADD途径招募FLICE(FADDlike ICE)/MACH(MORT1associated CED3 homolog)/caspase8，再激活caspase3，诱导细胞凋亡;(2)通过TNFR1TRADDTRAF(TNF receptorassociated factors)激活NFκB，TRADD还能通过DD招募RIP(reportor interecting protein)激活NFκB，活化的NFκB调控各种基因的表达，抑制细胞凋亡和促进炎症反应。但上述的经典模型已受到挑战，Harper等[6]研究表明，在初始膜基部TNFR1复合物中没有发现FADD以及caspase8被招募。Micheau等[7]提出，TNFR1介导凋亡的新途径：受到TNF的刺激后，TNFR1、TRADD、TRAF2和RIP等在膜上快速装配形成复合物Ⅰ，此复合物触发NFκB的活化，但迅速消失，大部分TRAF2和RIP在1 h内与TNFR1分离，接着TRADD的DD结合域再与FADD结合，进而招募、活化caspase8，形成复合物Ⅱ，诱导细胞凋亡。TNFR2虽不具有DD结构域，但有结合TNF受体相关因子(TRAF)的基序，TNFR2与TRAF结合形成复合体激活NFκB和JNK激酶，诱导基因转录，促进细胞存活、增殖和分化。Till等[8]将TNFR2的Met196替换为Arg，突变体TNFR2招募TRAF2的能力以及诱导依赖NFκB的基因如cIAP表达大幅减少，引起不同程度的慢性炎症机能紊乱。Liu等[9]研究认为TNFα是调节肾上腺皮质细胞凋亡的重要调节因子。本实验结果也显示，经TNFα处理过的Y1细胞的细胞凋亡率与对照组比较有明显差异(P&<0.05)，caspase 8/3活性明显增加(P&<0.05)，且这种趋势呈剂量和时间依赖性。提示TNFα可能通过诱导caspase 8/3的活性促进Y1细胞的凋亡。

　　TNFα在其介导的炎症反应过程中，可引起全身难以控制的“瀑布式炎症级联反应”或伴免疫功能的严重抑制，即全身炎症反应综合征或代偿性抗炎反应综合征，是患者死亡的主要原因。本研究的结果提示，TNFα作用与小鼠的肾上腺皮质细胞的增殖和凋亡密切相关，下一步将深入了解TNFα介导的炎症反应对小鼠肾上腺皮质功能的影响。

参考文献

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