HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞数量及其受体变化的研究

　　　　 作者：傅更锋　郝莎　赵俊丽　徐晓琴　丁萍　还锡萍　羊海涛　侯亚义

【摘要】 目的:研究人类免疫缺陷病毒1(HIV1)儿童感染者体内CD3dimCD56+细胞数量及部分细胞受体的变化。方法：采集11例经确认的HIV1儿童感染者和10例HIV1抗体阴性的健康儿童抗凝全血，应用流式细胞术对CD3dimCD56+细胞的数量和细胞上部分受体的表达进行测定。结果：HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞的数量显著多于健康儿童（P＜0.01）；HIV1儿童感染者与健康儿童比较，CD16无变化（P＞0.05），NKp30、NKG2D、KIR2DL1和CD244的表达极显著升高（P＜0.01），NKp44、NKp46、KIR3DL1和NTBA的表达显著升高（P＜0.05），NKp80的表达极显著降低（P＜0.01）。结论：HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞的数量显著多于健康儿童，并且细胞上受体的表达发生剧烈变化。

【关键词】 人类免疫缺陷病毒1　儿童感染者　CD3dimCD56+细胞　受体

　　Abstract:Objective To study the changes of CD3dimCD56+ cell and its receptors in HIV1 infected children. Methods Blood samples from 11 HIV1 infected children and 10 healthy children were collected in EDTA coated vacutainer.The number of CD3dimCD56+ cells and the expression of its receptors were determined by flow cytometry. Results The number of CD3dimCD56+ cell in HIV1 infected children was higher than that in healthy children. Compared with healthy children，no change was found in the expression of CD16 receptor in HIV1 infected children，but the expression of NKp30，NKG2D，KIR2DL1 and CD244 receptors was significantly increased(P＜0.01).The expression of NKp44，NKp46，KIR3DL1 and NTBA in HIV1 infected children was also increased(P＜0.05)，while the expression NKp80 receptor was decreased obviously(P＜0.01). Conclusion The number of CD3dimCD56+ cell in HIV1 infected children was higher than that in healthy children.The expression of CD3dimCD56+ receptors changes dramatically in HIV1 infected children.
　　
　　Key words:human immunodeficiency virus1; infected children; CD3dimCD56+ cell; receptor

　　CD3dimCD56+细胞是一种介于NK细胞和T细胞之间的特殊细胞群，在人体对外界病原微生物侵袭的免疫调节中发挥着重要作用。CD3dimCD56+细胞主要为NKT细胞，NKT细胞在人体的含量很低，一般占到外周血淋巴细胞总数的0.01%～1%［1］。在CD3dimCD56+细胞的表面表达有NK细胞受体和部分T细胞受体，通过这些细胞受体的变化，CD3dimCD56+细胞可以调节NK细胞、巨噬细胞、CD4+和CD8+ T细胞等效应细胞表达分泌Th1和Th3等细胞因子［2］。

　　CD3dimCD56+细胞主要为NKT细胞，NKT细胞表达CD4的同时高表达细胞趋化因子受体5（CCR5），因而CD3dimCD56+细胞也是人类免疫缺陷病毒1（HIV1）感染的靶点之一，所以CD3dimCD56+细胞在HIV1病毒感染中发挥着重要作用［3］。作者对HIV1儿童感染者CD3dimCD56+的数量和细胞表面部分NK细胞受体的表达进行了初步研究，报道如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　 江苏省疾病预防控制中心艾滋病确证中心实验室用MP公司的蛋白印迹试剂盒确认为HIV1抗体阳性的儿童11例，其中男孩8例，女孩3例，平均年龄（8±3.4）岁，所有阳性儿童均没有进入获得性免疫缺陷综合征（AIDS）期。10例HIV1抗体阴性健康儿童来自南京市儿童医院健康体检门诊，其中男孩5例，女孩5例，平均年龄（8.6±3.4）岁，血常规和肝肾功能检查正常，无免疫系统疾病史。所有标本均以BD公司4.0 ml真空管采集，EDTA抗凝，并在采集后6 h以内进行实验室检测分析。

　　1.2 试剂与仪器

　　除抗体以外的所有试剂和仪器均购自BD公司。CD56PECy5.5、CD3Alex Flour 488、CD16APC、NKG2DPE单克隆抗体购自Invitrogen公司，NKp80PE单克隆抗体来自RD公司，CD244PE单克隆抗体购自eBioscience公司，NKp44PE、KIR3DL1PE和NTBAPE单克隆抗体由Biolegend公司提供，KIR2DPE、NKp46PE和NKp30PE单克隆抗体购自BD公司。

　　1.3 NK细胞受体检测
　　
　　取200 μl抗凝血，以2 ml红细胞裂解液作用15 min，1 400 r·min-1离心5 min，PBS洗2次。按照抗体说明书的要求同时加入CD3和CD56两个抗体作标记，然后再分别加入需要检测的抗体，混匀后置4 ℃，避光孵育30 min。最后上机检测，获取104个细胞。同时设同型对照。以BD公司CellQuest软件，获取CD3dimCD56+细胞群，然后在这个细胞群里分析不同NK细胞受体在该群细胞表面的表达情况。

　　1.4 统计学处理

　　 所有数据均使用SPSS 11.5软件进行统计学分析，经数据分析为偏态分布者，进行对数转化为正态分布，然后用t检验进行均值的比较分析。

　　2 结 果

　　2.1 CD3dimCD56+细胞数量在HIV1儿童感染者中的变化

　　使用CD3和CD56标记并同时阳性的CD3dimCD56+细胞在HIV1儿童感染者体内的含量急剧上升（5.07%±2.70%），和健康儿童（0.13%±0.06%）比较有非常显著的差异（t=6.72，P＜0.01）。2.2 激活性受体在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达　　CD16、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46和NKp80是NK细胞的激活性受体，本研究检测了这些激活性受体在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的变化，结果显示：CD16在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达与健康儿童比较无明显变化，NKp30、NKG2D、NKp44和NKp46在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达明显上升，而另一个激活性受体NKp80在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达却显著降低（表1）。表1 激活性受体在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达变化（略）

　　2.3 抑制性受体在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达

　　在HIV1儿童感染者中，KIR2D和KIR3DL1两种抑制性受体的表达都明显升高。其中KIR2D在HIV1儿童感染者中的表达是5.65%±3.26%，健康儿童的表达是0.13%±0.09%，两者有极显著差异（t=5.63，P＜0.01）；KIR3DL1在HIV1儿童感染者中的表达是16.46%±10.18%，健康儿童是4.15%±2.79%，两者也有明显差异（t=3.86，P＜0.01）。
　　
　　2.4 协同活化受体在HIV1儿童感染者CD3dimCD56+细胞上的表达

　　在HIV1儿童感染者的CD3dimCD56+细胞上，CD244和NTBA的表达明显升高，分别是64.92%±21.55%和59.19%±10.46%，显著高于健康儿童的19.85%±6.88%（t=6.58，P＜0.01）和40.85%±22.81%（t=2.33，P＜0.01）。

　　3 讨论

　　 许多研究者把CD3dimCD56+细胞命名NKT细胞，NKT细胞被分为CD4+和CD4-两个细胞亚群，两者各占50%［45］。由于在CD4+NKT细胞上高表达CCR5，所以这部分细胞也是HIV1感染的靶点之一。而另外一些研究者则倾向于把CD3dimCD56+细胞命名为细胞因子诱导的杀伤细胞（cytokineinduced killer cell），他们认为，在体内IL2、TNFα和IFNγ等细胞因子均可以激活CD3dimCD56+细胞［68］。3个分别独立的实验证明，在HIV1感染过程中导致NKT细胞下降的速度远远高于CD4 T细胞［9］。我国学者姜拥军等也证实，在HIV/AIDS患者中，NKT细胞的平均值低于正常对照组NKT细胞的平均值［10］。而在我们的实验中发现，在中国HIV1儿童感染者中，CD3dimCD56+细胞在循环系统中的含量比健康儿童要高，并且，两者有着非常明显的差异。这一研究结果和其他研究者的结果不一致，导致在HIV1儿童感染者中CD3dimCD56+细胞升高的原因尚待进一步研究证实。

　　HIV1的母婴传播是不同于其他传播途径的传播方式，这是因为在怀孕过程中，胎儿和母亲共同使用许多相同的组织相容性抗原（histocompatibility complex，MHC）［11］。NK细胞的受体，如激活性受体CD16、NKp30、NKG2D、NKp44、NKp46和NKp80，抑制性受体KIR2D和KIR3DL1，以及协同活化受体CD244和NTBA就是识别与其功能及活性相关的MHC［1213］。本研究以母婴传播方式传播的HIV1儿童感染者为对象，初步探讨了NK细胞的不同受体在CD3dimCD56+细胞上的变化。我们的研究结果表明，在HIV1儿童感染者中，NK细胞受体在CD3dimCD56+细胞上的表达发生很大的变化。其中，除NKp80受体在HIV1儿童感染者中显著降低以外；其他受体，如激活性受体NKp30、NKG2D、NKp44和NKp46，抑制性受体KIR2D和KIR3DL1，以及协同活化受体CD244和NTBA在HIV1儿童感染者中的表达都是明显升高的。在HIV1感染者中，NK细胞受体的变化是非常剧烈的，通常NK细胞的抑制性受体的表达会被上调，相反，其激活性受体则被下调，从而使受HIV1感染的细胞“逃逸”机体的免疫监视，我们的部分研究结果与其他研究者的结果［1415］是一致的。让我们研究小组比较困惑的是，部分激活性受体在HIV1儿童感染者中的表达是升高的，这种现象是HIV1儿童感染者和成人感染者的不同，还是另外有其他原因，我们将在以后的研究工作中加以证实。所有的这些研究结果说明，在HIV1感染中，自然免疫细胞在对已经感染HIV1细胞的清除等方面发挥着巨大的作用［1617］。

　　近年来大量的研究成果表明，NKT细胞在HIV1感染过程中可能起到重要的免疫调节作用［18］。由于NKT细胞可以影响AIDS患者的转归和进程［19］，因此利用NKT细胞的这些功能可能会成为未来治疗HIV1感染的新型方案和疫苗研制的新策略。CD3dimCD56+的数量在HIV1儿童感染者中大量表达，这个细胞群的变化是否代表了NKT细胞群在这个感染群体中的变化，目前还没有相关研究结果支持。因此，本研究及我们对CD3dimCD56+细胞的后续研究，将为解决CD3dimCD56+细胞在HIV1感染过程中的具体作用和机制奠定一定的理论基础。

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