罗格列酮对高胆固醇血症大鼠心肌脂联素与TNFα水平的影响

　　　　作者：盛祖龙，胡定波，李荥娟，李艳志，任利群

【摘要】 　　目的：探讨高胆固醇血症大鼠心肌脂联素与TNFα水平变化及罗格列酮对其的干预作用。方法：28只雄性WistarKyoto大鼠，随机分为普通饲料组（Con组）、高胆固醇饲料组（Cho组）、高胆固醇饲料+罗格列酮组(Ros组)，罗格列酮溶于生理盐水清晨灌胃，4 mg·kg-1·d-1。Ros组在高胆固醇饮食适应性饲养1个月后开始药物干预，持续5个月。采用全酶法全自动生化分析仪测定大鼠血脂，应用酶联免疫吸附法测定心肌脂联素和TNFα水平。结果：Cho组血脂、心肌TNFα水平高于Con组，心肌脂联素水平明显降低；罗格列酮可明显降低血酯、心肌TNFα水平，升高心肌脂联素水平。且心肌酯联素与TNFα呈明显负相关（r=-0.636，P&<0.01）。结论：罗格列酮通过显著降低血脂及TNFα水平，同时升高心肌脂联素水平而发挥心肌保护作用。

【关键词】 脂联素； 肿瘤坏死因子α； 高胆固醇血症； 罗格列酮； 大鼠

　　［Abstract］ Objective:To investigate the effects of rosiglitazone on the levels of myocardial adiponectin and TNFα in a rat model with experimental hypercholesterolemia.Methods:Hypercholesterolemic rats were induced by a cholesterolrich diet.Twentyeight male WistarKyoto rats were randomly allocated into three groups:(1) the control group(Con group)，which was fed a regular diet;(2) the cholesterolrich diet group(Cho group)，which was fed a cholesterolrich diet;and (3) the rosiglitazone treatment group(Ros group)，which was fed a cholesterolrich diet plus rosiglitazone（rosiglitazone dissolved in saline in the morning gavage，4 mg·kg-1·d-1）.Drug treatment was started from 1 month after the start of the cholesterolrich diet， lasting for 5 months.Serum lipid，myocardial adiponectin and TNFα concentrations were measured using an automatic biochemical instrument and ELISA method，respectively.Results:In comparison with Con group，serum lipid and myocardial TNFα levels in the rats of Cho group were significantly higher after 6 months，while adiponectin was remarkably lower.Rosiglitazone evidently reduced serum lipids and TNFα levels，while elevated myocardial adiponectin.Moreover，myocardial adiponectin was negatively correlated with TNFα(r=-0.636，P&<0.01).Conclusion:The present findings suggest that rosiglitazone may exert myocardial protective action partially at least through the improvement of lipid metabolism，the increase in myocardial adiponectin and the reduction in myocardial TNFα level in the hypercholesterolemic
rat.

　　［Key words］ adiponectin; tumor; necrosis; factorα; hypercholesterolemia; rosiglitazone; rats

　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是配体激活的核转录因子，属于核受体超家族成员之一。噻唑烷二酮类药物（TZDs），包括罗格列酮、匹格列酮、曲格列酮等是PPARγ的配体激动剂。动物及临床研究均证实，TZDs类药物通过保护血管内皮功能、调节炎性细胞因子及表面黏附分子的表达、抑制巨噬细胞活化、抗氧化应激及抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移，从而抑制动脉粥样硬化（AS）的发生发展。脂联素(adiponectin)是由白色脂肪组织细胞分泌的一种具有心血管保护作用的细胞因子。近年研究发现，脂联素具有抗炎、胰岛素增敏、抗动脉粥样硬化等重要作用［1-2］，因此得到广大研究者的关注。肿瘤坏死因子(TNFα)是人们早已熟知的炎症介质之一，通过损伤内皮细胞、促进凝血、抑制纤溶、促进单核细胞对内皮细胞的黏附以及促进血管平滑肌细胞(VSMC)迁移、增殖等作用，参与动脉粥样硬化的发生、发展过程；另外，研究证实TNFα可降低血清脂联素水平。然而PPARγ配体激动剂罗格列酮干预后却显著抑制TNFα引起脂联素基因表达的下降［3］。本研究拟借助实验性高胆固醇血症大鼠模型，观察心肌组织局部脂联素和TNFα水平的变化以及罗格列酮对其的干预作用，进一步探讨罗格列酮心肌保护作用的分子机制。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 高胆固醇血症大鼠模型的建立
　　
　　4周龄健康雄性WistarKyoto大鼠（上海斯莱克实验动物责任有限公司提供），体重180～250 g，随机分为普通饲料组（Con组，n=8）、高胆固醇饲料组（Cho组，n=10）和高胆固醇饲料+罗格列酮干预组（Ros组，n=10）。Con组给予普通饲料喂养；Cho组给予高胆固醇饲料喂养；Ros组高胆固醇饲料适应性饲养1个月后开始给予罗格列酮（4 mg·kg-1·d-1）干预，持续5个月，所有鼠自由饮水。罗格列酮溶于1 ml生理盐水中清晨灌胃，每天1次。6个月时Cho组体重明显高于其余两组，腹型肥胖为特征，平均血总胆固醇为(4.7±0.6) mmol·L-1，明显高于普通饲料组以及正常大鼠血清胆固醇的平均值(2.41±0.05) mmol·L-1，提示造模成功。高胆固醇饲料由10%食用猪油、4%胆固醇、0.5%牛胆酸与85.5%普通饲料搅拌混匀配制而成，烘干制成颗粒状饲料。
　　
　　1.2 血脂测定
　　
　　禁食12 h，处死前首先电子秤称体重。采用去脊髓法使大鼠丧失意识，立即左心室穿刺取血10 ml，4 ℃、10 000×g离心15 min，分离血清，-80 ℃保存。采用全酶法全自动生化分析仪测定TG（三酰甘油）、TC（总胆固醇）、LDLC（低密度脂蛋白）水平。
　　
　　1.3 心肌脂联素和TNFα水平的测定
　　
　　取左室心肌组织50～100 mg，加生理盐水0.5～1 ml，匀浆器10 000×g低温匀浆，按1∶15的比例［V(ml)/W(mg)］加入浓度为0.2 mol·L-1的冰醋酸，煮沸15 min，4 ℃、10 000×g离心15 min，取上清液分装，-80 ℃保存成批测定。采用酶联免疫吸附法测定心肌组织中脂联素和TNFα水平（脂联素ELISA试剂盒购自ADL公司，TNFα ELISA试剂盒购自晶美公司）。心肌组织脂联素和TNFα水平按照下述公式计算：心肌组织脂联素（μg·mg-1）水平=上清液中脂联素（μg·ml-1）浓度/上清液总蛋白含量（mg·ml-1）;TNFα（pg·mg-1）水平=上清液中TNFα（pg·ml-1）浓度/上清液总蛋白含量（mg·ml-1）。考马斯亮蓝法测定心肌组织上清液中总的蛋白含量。
　　
　　1.4 统计学处理
　　
　　计量资料以x-±s表示，数据用SPSS 13.0统计软件处理，Oneway ANOVA方法进行组间差异显著性检验，Pearson进行相关分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 血脂水平
　　
　　与Con组相比，高胆固醇饲养6个月引起明显的高胆固醇血症，包括TG、TC和LDLC水平的升高（P&<0.01）；罗格列酮能够明显抑制TG、TC和LDLC水平的升高（P&<0.01）。见表1。
　　
　　2.2 心肌脂联素水平
　　
　　Cho组心肌脂联素水平明显低于Con组（P&<0.05）；罗格列酮干预后可明显升高心肌脂联素水平（P&<0.01）。见表1。表1 各组间血脂、心肌脂联素和TNFα水平的比较（略）

　　2.3 心肌TNFα水平
　　
　　Cho组心肌TNFα水平明显高于普通饲料组（P&<0.01）。罗格列酮可明显降低心肌TNFα水平（P&<0.01），见表1。

　　2.4 心肌脂联素和TNFα水平的相关分析
　　
　　心肌组织中脂联素和TNFα水平相关性分析结果显示，二者呈明显负相关（r=-0.636，P&<0.01)。

　　3 讨论
　　
　　众所周知，高胆固醇血症与肥胖、动脉粥样硬化、代谢综合征、糖尿病、高血压等疾病密切相关，是心脑血管疾病的重要危险因素之一，在心肌能量代谢、动脉粥样硬化形成等方面有着重要的影响。在高胆固醇饲料饲养复制的动脉粥样硬化家兔模型中，不仅主动脉和冠状动脉呈现病理性改变，而且心、肝、脾、肾上腺等一系列重要脏器均出现明显的损伤［4］。实验已经证实，高胆固醇血症诱发心肌细胞氧化应激和亚硝化应激反应可导致心肌重塑、功能障碍［5-6］和心肌坏死纤维化［4］。Zhu等［5］研究发现，在高脂饮食饲养诱发的高脂血症猪模型中心肌Ⅰ/Ⅲ胶原值增加，心肌细胞凋亡增加，同时伴随心肌舒张功能的减低。而近年来大量研究［7］证实，PPARγ可通过调节脂质代谢、抗炎、抗动脉粥样硬化、减少支架内再狭窄、抑制心血管重构等发挥心血管保护作用。罗格列酮属于噻唑烷二酮类药物，是PPARγ特异性配体激动剂。有研究证实，罗格列酮能够逆转心脏间质纤维化，改善左心室舒张功能的作用［8］，但罗格列酮对心肌保护的分子机制尚不明确。本研究旨在通过观察高胆固醇血症大鼠心肌脂联素和TNFα水平的变化以及罗格列酮对其的干预作用，探讨罗格列酮对高胆固醇血症大鼠的心肌保护机制。
　　
　　PPARγ是体内脂质代谢调节的核心因子，本研究结果证实，罗格列酮可显著抑制高胆固醇饲养诱发的大鼠TG、TC、LDLC水平升高。目前在脂质代谢调节过程中，脂肪组织分泌的脂肪细胞因子倍受关注，包括脂联素、瘦素、抵抗素、网膜素、TNFα、视黄醇结合蛋白4等以及其他的生物活性物质如脂肪酸、类固醇激素、生长因子和前列腺素。脂联素是一个保护性细胞因子，它可通过促进脂肪酸氧化和葡萄糖摄取，参与葡萄糖、脂肪及能量代谢的调节。研究证实心脏60%的能量供给来源于脂肪酸的氧化，40%主要来源于葡萄糖。心肌细胞不仅分泌脂联素［9］，而且存在脂联素特异性结合受体［10］。因此脂肪细胞和心肌细胞分泌的脂联素对于调节心脏能量代谢、维持正常的收缩功能极其重要。已有研究表明，高脂饮食能显著降低脂肪组织脂联素mRNA和蛋白表达水平［11］，减肥或予以降低血脂水平可以增加血清脂联素水平［12］。PPARγ的活化一方面通过改善脂质代谢升高脂联素水平，另一方面直接激活脂联素启动子介导脂联素的分泌［13］。Iwaki等［14］发现，人类脂联素基因的启动子中包含PPRE位点(-273～-285)，同时发现PPARγ激活剂可以诱导脂联素启动子的活性升高5～10倍。在PPRE的下游还存在肝受体同源物1(LRH1)的应答元件(LRHRE)，定位于人类脂联素启动子的-237～-229。LRH1与LRHRE结合成一种感受态因子，增强PPARγ/PRXR的转录活性，促进脂肪细胞合成和释放脂联素。本实验结果也显示高脂饲料饲养6个月后，Cho组心肌脂联素明显低于Con组，而罗格列酮干预后心肌局部脂联素水平明显升高，与薛青等［15］研究发现罗格列酮能够提高糖尿病患者血循环中脂联素水平的结果基本一致。
　　
　　另外，机体内的炎症介质因子形成一个错综复杂的网络系统，参与了心血管疾病、2型糖尿病、代谢综合征的病理过程。最新研究证明，脂联素能调节与炎症、胰岛素抵抗、动脉粥样硬化等相关细胞因子的产生。Sell等［16］研究结果显示，脂联素可下调脂肪细胞分泌IL6、IL8、巨噬细胞炎症蛋白1α/β和MCP1。同时脂联素通过与MCP1等趋化因子结合，聚集在炎症部位而发挥其抗炎作用［17］。PPARγ激动剂可增加脂联素mRNA的稳定性，促进脂联素蛋白的合成、稳定和释放，使升高的TNFα恢复正常，逆转TNFα介导的对脂联素mRNA表达的抑制作用［18］。本研究结果显示，高胆固醇血症大鼠心肌中TNFα水平明显升高，并与脂联素水平呈现明显的负相关关系；罗格列酮不仅明显降低心肌组织TNFα水平，同时升高脂联素水平，由此可见罗格列酮不仅抑制了心肌的损伤机制即降低TNFα，而且增强了保护性机制即升高心肌脂联素水平，从而拮抗高胆固醇血症诱发的心肌损伤。
　　
　　综上所述，罗格列酮改善高胆固醇血症大鼠的脂质代谢、升高心肌组织脂联素水平、降低心肌组织TNFα水平可能是其发挥心肌保护作用的新机制。

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