缺氧肝细胞对肝星状细胞基质金属蛋白酶2表达及活性水平的影响

【摘要】 　　目的：探讨缺氧肝细胞对大鼠肝星状细胞基质金属蛋白酶2(MMP2)表达及其活性的影响。方法：缺氧培养肝细胞BRL3A(氧浓度5%)12 h后取其培养上清作为条件培养基，培养肝星状细胞HSCT6，设6、12、24 h 3个时间点，RTPCR、酶图法分别检测HSCT6 MMP2 mRNA表达及其酶活性。以无血清DMEM培养肝星状细胞作为对照组。结果：随条件培养时间的延长，缺氧条件培养组HSCT6 MMP2活性均升高(30.74±8.22、31.71±8.10、49.79±13.61)，且高于对照组(18.58±1.62、25.98±2.73、32.14±3.76)，但扣除本底后缺氧条件培养基组HSCT6 MMP2活性(12.99±2.05、14.01±2.00、29.44±3.62)均低于相应对照组，在6 h和12 h时间点差异有统计学意义(P6 h=0.039，P12 h=0.007)，缺氧条件培养基组HSCT6 MMP2 mRNA表达量(0.44±0.07、3.66±1.10、4.29±0.99)高于相应对照组(0.61±0.07、2.50±0.27、0.52±0.16)，差异具有统计学意义(P6 h=0.044，P24 h=0.030)。结论：物理缺氧条件下，肝细胞分泌或释放了可溶性物质作用于肝星状细胞，使其MMP2表达上调，活性下降。肝细胞分泌或释放了何种物质尚待进一步研究。

【关键词】 基质金属蛋白酶2； 缺氧； 肝细胞； 肝星状细胞； 相互作用

　　［Abstract］ Objective：To investigate the effects of hypoxic hepatocytes on the expression and the activity of matrix metalloproteinase2(MMP2) in rat hepatic stellate cells.Methods： Hepatocytes (BRL3A) were cultured in Dulbecco′s modified eagle medium with 10% fetal calf serum at 37 ℃ and 5% CO2.When reaching confluence，the hepatocytes were incubated in serumfree medium and put into the hypoxiabox，in which the concentration of oxygen was 5%.After 12 h，the supernatants were harvested，and were used to culture rat hepatic stellate cells (HSC cell line) for 6 h，12 h，24 h respectively.And then the supernatants and the cells were harvested.The expression of the MMP2 mRNA in HSC cells was detected by RTPCR.The activity of the MMP2 in the supernatant was detected by zymography.Results：The expression of MMP2 in the hypoxic conditional groups at three time points (0.44±0.07，3.66±1.10，4.29±0.99) were higher than those in the control groups (0.61±0.07，2.50±0.27，0.52±0.16)，P6 h=0.044，P24 h=0.030.However the activity of MMP2 in the hypoxic conditional groups (12.99±2.05，14.01±2.00，29.44±3.62) were lower than those in the control groups (18.58±1.62，25.98±2.73，32.14±3.76)，P6 h=0.039，P12 h=0.007.Conclusion：Hypoxic hepatocytes may secret some substances to promote MMP2 expression but depress the activity in hepatic stellate cells，and the effect correlated with the time.It is worth to studying further that what the substances are.

　　［Key words］ matrix metalloproteinase2; hypoxia; hepatocyte; hepatic stellate cell； cells crosstalk
　　
　　肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理学表现，肝星状细胞(hepatic stellate cell，HSC)活化是肝纤维化过程中的关键环节。活化后的肝星状细胞分泌基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase，MMP2)，而MMP2通过降解Ⅳ型胶原从而改变细胞外的基膜样基质而参与肝星状细胞活化和移行［1］。氧作为细胞赖以生存所必需的营养物质，其供应异常显然将导致细胞功能紊乱。我们的前期研究［2-4］发现，物理性缺氧和化学性缺氧都会影响HSC MMP2表达及酶活性。在肝脏缺氧状态下，作为肝脏主体细胞，同时也是HSC的近邻——肝细胞，是否调节HSC表达MMP2有待阐明。

　　1 材料和方法
　　
　　1.1 肝细胞缺氧处理和HSC缺氧条件培养
　　
　　大鼠肝细胞株BRL3A(购自中国科学院上海细胞库)和大鼠HCS株HSCT6(来源于美国Friedman实验室)分别以2×105 ml-1细胞量接种于6孔塑料培养板中，用含10%优级胎牛血清的低糖DMEM培养液培养于37 ℃、体积分数为5%的CO2恒湿培养箱中。肝细胞铺满孔底80%左右倾去完全培养基，PBS冲洗2遍后加入无血清低糖DMEM，将培养板放入自制缺氧盒内(容积1 L)，盒内通入氮气，测氧仪(上海雷磁新泾仪器有限公司，RSS5100型)监测氧浓度，当氧浓度达到5%时停止充氮气并密封缺氧盒。37 ℃、恒湿培养箱中培养12 h后，取其离心后培养上清作为缺氧条件培养基培养HSC，分设6、12、24 h 3个时间点，各时间点设4复孔，将此4孔作为缺氧条件培养基组；以无血清DMEM培养HSC作为对照组，每个时间点设2复孔。在37 ℃、体积分数为5%的CO2恒湿培养箱中培养至设定时间收集上清，离心去沉渣，用透析袋浓缩蛋白并定量后作明胶酶谱检查，细胞用Trizol reagent(购自Invitrogen公司)处理，提取总RNA，检测MMP2 mRNA表达。
　　
　　1.2 明胶酶谱法检测MMP2活性
　　
　　参照Carney等［5］的方法，用含1 mg·ml-1明胶(Sigma公司产品)的8% SDSPAGE制备电泳板。条件培养基及其培养星状细胞后的培养上清、对照组上清，分别放入截留相对分子质量为35的透析袋中，包埋于聚乙二醇中40 min。上述浓缩后的上清蛋白定量后，取含15 μg总蛋白的上清与加样缓冲液混合，并用加样缓冲液补齐上样。电压100 V，电泳2～3 h，取出凝胶，用Zymogram A buffer(北京普利莱基因技术有限公司)漂洗2次，每次1.5 h，Zymogram B buffer(北京普利莱基因技术有限公司)孵育过夜，考马斯亮蓝(北京普利莱基因技术有限公司)染色2 h，脱色至蓝色背景有透明条带出现为止。复日Smart生物电泳图像分析仪扫描，进行密度分析。
　　
　　1.3 RTPCR检测MMP2 mRNA表达
　　
　　MMP2、内参βActin引物由Invitrogen公司合成。MMP2引物：正义链为5′CATCGTACTCCTCGTTGCTG ATCCACAT3′，反义链为5′CTCCCTCATGCCATCCTG CGTCTG3′，扩增片段长度为228 bp。内参βActin引物：正义链为5′CATCGTACTCCTGCTTGCTGATCCAC AT3′，反义链为5′CTCCCTCATGCCATCCTGCGTCT G3′，扩增片段长度为679 bp。用Trizol reagent提取HSCT6总RNA，取1 μg进行逆转录。反应体系如下：RNAse free h3O 7.5 μl，25 mmol·L-1 MgCl2 4 μl，10×buffer 2 μl，dNTP 2 μl，Oliged T 1 μl，AMV 1 μl，RNAse inhibitor 0.5 μl，RNA 1 μg，补水至20 μl，30 ℃反应10 min，42 ℃ 40 min，95 ℃ 5 min；取2 μl逆转录产物，依次加入10×buffer 2.5 μl，上、下游引物各1.5 μl，5 U·μl-1 TqE 0.3 μl，dNTP 2 μl，加入灭菌的双蒸水至反应总体积为25 μl。MMP2扩增反应条件：94 ℃ 5 min，94 ℃ 30 s，62.5 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共36个循环，72 ℃延伸10 min；扩增产物在1.5%的琼脂糖凝胶上进行电泳，复日Smart生物电泳图像分析仪扫描，进行密度分析和半定量比较，以每个标本的目的条带与该标本βactin条带密度的比值作为该标本目的基因的相对表达量。
　　
　　1.4 统计学处理
　　
　　采用SPSS 13.0软件作统计分析，数据用x-±s表示，组间比较用独立样本t检验，P＜0.05表示差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 HSCT6 MMP2活性改变

　　随着培养时间的延长，缺氧条件培养基组和对照组HSCT6产生的MMP2活性均逐渐升高，但是扣除条件培养基内由肝细胞产生的MMP2后发现(图1、2)，各时间点缺氧条件培养基组MMP2活性(12.99±2.05、14.01±2.00、29.44±3.62)均低于相应对照组(18.58±1.62、25.98±2.73、32.14±3.76)，缺氧条件培养基组与对照组6 h和12 h时间点之间HSCT6 MMP2活性差异有统计学意义(P6 h=0.039，P12 h=0.007)。
　　
　　2.2 MMP2 mRNA表达
　　
　　随着时间的延长，缺氧条件培养基组和对照组HSC MMP2 mRNA均表达增加(图3、4)，各时间点条件培养基组的MMP2相对于内参βactin的灰度比值分别为0.44±0.07、3.66±1.10、4.29±0.99，对照组为0.61±0.07、2.50±0.27、0.52±0.16，缺氧条件培养基组和对照组6 h和24 h时间点之间MMP2 mRNA表达差异有统计学意义(P6 h=0.044，P24 h=0.03)。

　　3 讨论
　　
　　肝纤维化是许多慢性肝病共同的病理过程，是肝脏的修复性反应，主要表现为细胞外基质(extracellular matrix，ECM)合成和降解失衡，合成的ECM不仅量增多，其组分也发生了变化，Ⅰ型和Ⅲ型胶原纤维分泌增多，Ⅳ型胶原增多并且逐渐相互连接，沉积于肝窦周围，使肝窦毛细血管化［6］。而MMP2(又称明胶酶A)作为主要降解Ⅳ型胶原的酶，主要由活化的HSC分泌。MMP2通过降解ECM改变细胞周围的基膜样基质，又可以促进HSC的活化，活化后的HSC又分泌大量的MMP2，单从这一方面讲，二者是一个典型的正反馈过程。在肝纤维化过程中，Ⅳ型胶原的沉积提示MMP2对其降解力度不够或酶的作用环境改变。显然，若在肝纤维化病程的不同阶段，人为干预该酶的表达和活性有可能延缓肝纤维化的发展，所以探明调节MMP2表达及活性的因素不论对该病的预防还是治疗均有十分重要的意义。
　　
　　氧是生命赖以生存的营养物质，其供应异常必然将导致细胞功能紊乱，肝脏感染和损伤是肝脏缺氧的主要因素。体内研究结果提示，氧能通过调节HSC MMP2表达及活性而影响肝纤维化的发展。在早期MMP2表达少、活性低，HSC活化少，不利于肝纤维化的启动；而在纤维化形成期，MMP2活性高，有利于Ⅳ型胶原的降解和HSC的活化。本组前期的体外实验证实，化学缺氧和物理缺氧均能使HSC MMP2 mRNA表达上调，同时酶活性下降。缺氧诱导因子(hypoxia inducing factor 1α，HIF1α)可能参与了缺氧条件下MMP2的表达调节。最近我们发现，纤维化肝组织表达HIF1，而且几乎全是纤维间隔附近肝细胞表达。提示作为肝脏的主体细胞以及HSC的近邻——肝细胞在氧对HSC MMP2表达及活性调节中可能起重要作用。
　　
　　本实验从细胞间相互作用的角度来研究MMP2的表达和酶活性的变化，探讨肝细胞缺氧对HSC MMP2表达及活性的影响，结果发现其表达量随时间的延长逐渐增加，缺氧条件培养12 h时达到高峰，24 h时下降，说明缺氧肝细胞条件培养基能够促进HSC MMP2 mRNA表达，也就是说肝细胞在缺氧条件下分泌或释放了可溶性物质，并作用于HSC使其MMP2转录增加，这种作用在24 h内持续存在。酶谱显示缺氧条件培养基组MMP2的活性反而下降，说明肝细胞缺氧时分泌某种物质，在MMP2翻译或者活性水平上作用于HSC，使MMP2的活性降低。
　　
　　作为肝脏的主体细胞、HSC的近邻，肝细胞与HSC的相互作用是十分复杂的［7］。正常情况下肝细胞可以分泌许多细胞因子如TGFβ、TNFα等；缺氧时HIF1等因子也表达增加。我们前期体外实验发现，物理缺氧和化学缺氧均能使HSC MMP2 mRNA表达增加而活性下降。本研究结果表明，缺氧肝细胞也可以使HSC产生同样的效应。由此可见，缺氧情况下，肝细胞及HSC均能产生调控MMP2表达和活性的物质，且两种细胞产生的这些物质是相似的，因而有相同效应。目前已清楚，HIF1是缺氧细胞所产生的关键转录因子，众多研究［8］证实，氧对细胞功能活动的调节与HIF1有关。肝细胞缺氧损伤后可能会有活性氧自由基的释放，也可能有HIF1下游分子的表达释放，如胰岛素样生长因子、内皮素、瘦素、血管内皮生长因子等，甚至上清内离子浓度的改变均可能影响HSCs MMP2表达及酶活性。这些因子可以通过作用于MMP2的表达、翻译、修饰产生影响［9］。也可能参与其中的不是单一的一种物质，可能是两种甚至两种以上的细胞因子的综合作用。这些物质是什么，通过什么途径作用于HSC以及通过什么信号通路发挥作用值得进一步深入研究。

参考文献

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　　［4］范任华，陈平圣，赵迪，等.化学缺氧对肝星状细胞基质金属蛋白酶2表达及活性的影响［J］.中华肝脏病杂志，2007，15(9):654657．

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　　［6］KUMAR M，SARIN S K.Is cirrhosis of the liver reversible？［J］.Indian J Pediatr，2007，74(4)：393399．

　　［7］MABUCHI A.Role of hepatic stellate cell / hepatocyte interaction and activation of hepatic stellate cells in the early phase of liver regeneration in the rat［J］.J Hepatol，2004，40(6): 10231026．

　　［8］SEMENZA G L.Life with Oxygen［J］.Science，2007，318(5847):6264.

　　［9］NELSON K K，MELENDEZ J A.The powerhouse takes control of the cell: the role of mitochondria in signal transduction［J］.Free Radical Biol Med，2004，37(6)：768784.