纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结的实验研究

　　　　　　作者：陈卫东，汤文浩，柏志斌

【摘要】 　　目的：通过纳米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，为纳米炭应用于胃癌的临床研究打下基础。方法：兔胃癌病灶周围浆膜下分别注射99TcmSC和纳米炭混悬液（卡纳琳），记录两种示踪法检测到前哨淋巴结（SLN）的例数、SLN数目及分布情况，计算两种示踪法检测SLN的敏感性、特异性、假阴性率和预测区域淋巴结转移的准确性以及SLN和非前哨淋巴结（NSLN）的转移率。结果：纳米炭与99TcmSC SLN的检出率及数目，显示SLN分布情况、SLN的转移率差异均无统计学意义（P＞0.05）。两种示踪法检测SLN的敏感性、特异性、假阴性率、准确性差异均无统计学意义（P＞0.05）。结论：纳米炭示踪胃癌前哨淋巴结效果与放射性核素99TcmSC是一致的，但纳米碳示踪法具有显影快而持久、无放射性、使用方便等优点，可替代放射性核素用于胃癌的临床研究。

【关键词】 胃癌； 前哨淋巴结； 纳米炭

　　［Abstract］Objective: To evaluate the clinical application of nanocarbon in visualization of sentinel lymph node (SLN) in gastric cancer surgery.Methods: Rabbit gastric cancer model was established by transplantation of VX2 cells into the gastric serosa.Nanocarbon and 99TcmSC were injected respectively into the gastric wall in rabbit model of gastric cancer.The cases，the numbers and the distribution of SLN were documented.Then the sensibility，specificity，false negative rate and the accurate rate of local lymph node metastasis were calculated，the metastasis ratio of SLN，NSLN were evaluated.Results:As far as the isolating rate，the numbers，the distribution and the metastasis rate of SLN was concerned，no significant difference was shown between the two groups（P＞0.05）.Moreover，the sensibility，specificity，false negative rate and the accurate rate of local lymph node metastasis were not difference between two groups（P＞0.05）.Conclusions:Nanocarbon has a similar effect with 99TcmSC in SLN visualization.Furthermore，it can be used in gastric cancer surgery to replace radionuclide，considering its quickdetection，nonradioactivity and convenience.

　　［Key words］ gastric cancer; sentinel lymph node; nanocarbon
　　　　
　　前哨淋巴结（sentinel lymph nodes，SLN）是指最先接受肿瘤引流的第一组区域淋巴结。前哨淋巴结的概念首先应用于阴茎癌患者区域淋巴结状况的评估［1］，此后，前哨淋巴结活检(SLNB)在临床上相继应用于乳腺癌、甲状腺癌、外阴癌、头颈部肿瘤等实体肿瘤，以指导手术方案的制定。国内外的学者也基本达成共识：如果SLN无肿瘤细胞转移，那么其他区域性淋巴结发生肿瘤转移的可能性极小，不必进一步扩大手术范围；如果前哨淋巴结有转移，则其他淋巴结转移的危险性很大，需要扩大手术范围［23］。然而，前哨淋巴结活检技术应用于胃癌的临床还有争议［4］。本研究通过纳米炭示踪兔胃癌前哨淋巴结的对照研究，为纳米炭应用于胃癌的临床研究打下基础。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 材料、试剂及仪器
　　
　　VX2细胞株（东南大学放射与介入中心提供）；日本大耳兔36只，雌雄各18只（东南大学医学院动物实验中心提供，3～4月龄，体重2.0～2.5 kg）；纳米炭混悬液（重庆莱美药业产品，平均粒径129 nm）；放射性核素99TcmSC（南京森科医药技术有限公司产品）；γ计数器探测仪NAVIGATOR GPS（美国外科公司产品）；显微摄像系统（日本Nikon公司产品）；普通显微镜（Olympus公司产品）；腹部手术器械（东南大学医学院动物外科提供）。
　　
　　1.2 实验方法

　　1.2.1 VX2传代兔的制备

　　将-196 ℃液氮保存的VX2肿瘤细胞株按一般细胞培养技术进行复苏后，将肿瘤细胞悬液调整成106 mm-3活细胞浓度。取该悬液0.5 ml接种于4只种兔后腿外侧的肌肉内，2周后可触及肿块即制成了荷瘤兔。取荷瘤兔后腿生长活跃的肿瘤组织，剔除筋膜和坏死组织，取边缘生长旺盛的鱼肉样组织，剪成1～2 mm3大小组织块用于种植。

　　1.2.2 兔VX2胃癌模型的制作

　　剩余32只大耳兔称重，静脉麻醉后，取仰卧位固定，上腹部局部剃毛，碘伏消毒。取上腹正中切口进腹（切口长2～3 cm），找到胃窦部，切开胃窦前壁浆肌层，将肿瘤组织块2枚装载于硬膜外穿刺针内，通过硬膜外穿刺针将肿瘤组织埋植于黏膜下，结扎预置的浆肌层缝线，关闭胃壁伤口，关腹。麻醉清醒后送动物中心喂养。

　　1.2.3 胃癌前哨淋巴结两种示踪方法的对照研究

　　动物喂养3周后再次剖腹，统计建模成功率。于荷瘤兔胃肿瘤病灶周围1.0 cm处选择四点，每点浆膜下分别注射99TcmSC 0.1 ml（0.2 μCi）和纳米炭0.1 ml（5 mg）。纳米炭注射试剂后1～5 min就会显示出2～4条染色的细小淋巴管，沿着显影的淋巴管就会发现黑染的淋巴结，最早被染色的淋巴结判定为纳米炭组前哨淋巴结（SLN），观察并记录被纳米炭黑染的前哨淋巴结数目和分布情况。99TcmSC注射后每隔10 min分别用γ闪烁计数器（NAVIGATOR GPS）检测99Tcm示踪的前哨淋巴结的数目和分布情况，直至120 min结束；γ闪烁计数器探测放射线水平高于背景10倍以上的淋巴结判定为核素组SLN，记录其数目及分布情况。分别切取纳米炭和99TcmSC示踪的SLN、胃肿瘤病灶及胃区域非前哨淋巴结（NSLN）作病理分析。

　　1.2.4 病理学检查

　　两种方法示踪的SLN、胃肿瘤病灶及NSLN（非前哨淋巴结）等标本经10%甲醛溶液固定后，制作石蜡切片，HE染色，观察胃肿瘤病理特征、SLN的转移及NSLN的转移。
　　
　　1.3 统计学处理
　　
　　实验数据以x-±s或百分率表示，组间计量资料比较采用t检验；计数资料比较进行卡方检验（或Fisher′s exact检验）。应用SPSS 13.0 for Windows统计软件完成，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 建模成功率
　　
　　32只实验动物于胃窦前壁种植VX2肿瘤组织块，3周后有27只在胃窦部发现肿瘤并经病理证实为恶性肿瘤组织，建模成功率为84.4％（27／32）；肿瘤直径为0.5～2.4 cm，平均（1.33±0.39） cm；胃肿瘤分期：ⅠB期10例，Ⅱ期9例，ⅢA期3例，ⅢB期2例，Ⅳ期3例。
　　
　　2.2 两种示踪法检测SLN的比较
　　
　　见表1。表1 两种示踪法检测SLN比较（略）

　　2.3 两种示踪法检测SLN的正确性比较
　　
　　见表2。表2 两种示踪法检测SLN的正确性比较（略）

　　2.4 纳米炭示踪的SLN黑染的程度及淋巴管显影情况

　　见图1、2。
　　
　　2.5 两种示踪法的检测SLN所需时间
　　
　　纳米炭法检测SLN所需时间为（4.06±2.12） min；核素法(28.17±13.48） min，两者差异有统计学意义（P&<0.01）。其中纳米炭示踪的SLN在实验观察的120 min内无明显褪色。
　　
　　2.6 SLN与非前哨淋巴结（NSLN）转移率比较
　　
　　两种示踪法共检测SLN共41枚，其中转移SLN 18枚，转移率为43.9％；27只兔共切取NSLN 244枚，其中转移淋巴结39枚，转移率16.0％，两者比较差异有统计学意义（P&<0.01）。

　　3 讨论
　　
　　在我国胃癌发病率居消化道恶性肿瘤的首位，并有上升趋势。手术是目前惟一有可能治愈胃癌的方法。胃癌的预后直接与肿瘤浸润程度、淋巴结转移或肝和腹膜转移等因素相关［5］。在日本，根据消化道肿瘤的外科和病理学研究，以上因素已作为肿瘤分期的标准；其中淋巴结转移在生存率的多因素分析中是一重要的影响因素［67］。术中是否彻底清除了转移淋巴结是影响手术疗效的关键，临床上常见有两种倾向：（1） 大范围的淋巴结清扫，切除很多没有转移的无辜淋巴结及其组织，造成并发症增多；（2） 切除范围不够，造成转移淋巴结残留，导致日后很快复发。如何根据每个个体确定科学合理的淋巴结清扫范围，这是外科医师共同关注的问题，也是胃癌外科的难点所在。前哨淋巴结的概念为其提供了理论依据。
　　
　　目前，前哨淋巴结有两种常用的检测方法：一种放射性核素法，即使用放射性核素标记物作为示踪剂，术中γ计数器探测仪检测手术区域，探测放射线水平高于背景10倍以上的淋巴结作为前哨淋巴结，术后γ计数器探测仪检测术后标本。此法简单，放射性核素在前哨淋巴结内停留时间较长，并且可记录，显像灵敏度较高。但Masahiro等［8］则认为，由于受到原发病灶放出的γ射线的影响，放射性核素示踪很难明确检测出前哨淋巴结；另外患者和医护人员要接触放射性物质；放射性物质来源困难，使用受限制。另一种是染色剂染色显影法，常用的染色剂有亚甲蓝、专利蓝、isosulfan blue等染料。染色显影法简单，可以清晰显示淋巴管和淋巴结，具有实时观察的优点，且医患无须接触放射性同位素，不需要特殊的设备和仪器，显像时间短而且直观，可以指导术中手术操作，医疗成本低。但染色显影法存在染色需较长的时间且着色不充分、染色剂淋巴结内滞留时间短、淋巴特异性差、术中使用会造成淋巴管、组织间隙广泛染色等缺点，而且有1.5％的患者对染色剂过敏。
　　
　　纳米炭混悬注射液为淋巴示踪剂，具有吸附性能优良、淋巴靶向性极高、组织内滞留性和示踪速度良好、不进入血液循环等特点，其团粒粒径平均为129 nm。注射到肿瘤局部组织后，可被巨噬细胞吞噬。同时，由于毛细血管内皮细胞间隙为20～50 nm，而毛细淋巴管内皮细胞间隙为120～500 nm，且基膜发育不完全，故纳米炭粒不进人血管，迅速进人淋巴管，滞留集聚到淋巴结，数分钟内能使引流淋巴结明显而持久地染色，便于术中辨认，减少组织损伤，增加清除淋巴结的数目，减少肿瘤复发的几率。在这些被黑染的淋巴结中，有些淋巴结虽然直径在0.2～0.3 cm，但已有转移，这些微小的淋巴结在常规根治术中易被忽略，而采用本方法很容易找到而被清除。本实验中纳米炭与放射性核素99TcmSC在胃癌SLN的检出数目、检出率、分布规律、敏感性、特异性、假阴性率和预测区域淋巴结转移的准确性等方面无明显差异；纳米炭淋巴结平均显影时间为（4.06±2.12） min，显影时间明显较99TcmSC缩短，且淋巴结染色满意，完全黑染率为 77.8％；操作较简单，医患无须接触放射性核素，不需要特殊的设备和仪器，显像直观，能够替代放射性核素用于胃癌前哨淋巴结的检测，更适合于手术中使用。
　　
　　胃周淋巴结根据JRSGC规则主要分为3站18组，这些不同分组的淋巴结虽分别代表胃不同区域的淋巴回流，但其互相成网状沟通。一般情况下，胃淋巴由第1站向第2、3站引流，但胃癌的淋巴引流是复杂的，SLN有随机性、多向性和跳跃性的特点。Sano等［9］的研究表明，首先转移的淋巴结仅62％在病灶周围，“跳跃转移”的几率高达13％，且淋巴回流径路可因人和病灶而异，使得应用示踪剂定位的胃癌SLN分布难以预测。本实验27只实验兔中SLN仅位于N1的占65.2％，仅位于N2的占13.6％，与上述结果相仿，也存在“跳跃转移”。而SLN的定义是首先接受肿瘤淋巴液，最早转移的淋巴结，均可认为是SLN。淋巴结转移的“跳跃性”只是相对于解剖位置而言。因此，我们理解，与其说SLN是一形态、解剖学概念，不如说是功能、外科学概念。当首先转移的淋巴结出现在N2或N3时，功能上其实相当于N1。如果SLN检测能发现胃癌异常解剖部位的“跳跃性”转移淋巴结，将对指导胃癌手术切除范围、提高胃癌分期准确性有重要意义。Gervasoni等［10］研究发现，如果区域淋巴结转移的机会&<5％，不做广泛的淋巴结清扫是可以接受的，胃癌的SLNB允许有5％的假阴性率。本实验SLN转移率明显高于NSLN转移率，说明胃癌淋巴结转移最易发生在SLN。因此，本研究也证实了SLN概念同样适用于胃癌，可在术中通过示踪剂准确识别，并能准确反映胃癌周围淋巴结的转移情况。
　　
　　根据纳米炭对淋巴结的高亲和性和炭的吸附性能，近来有学者将其吸附化疗药物后，作为淋巴靶向化疗，功能性缓释给药。这能提高淋巴结内化疗药物的浓度，更好地发挥对癌细胞的杀灭作用，克服化疗药物全身使用所致的严重毒副反应；术前及术中使用可防止医源性肿瘤扩散，对失去手术机会的晚期或复发癌肿可作定向化疗，改善症状，提高生活质量，延长生命。

参考文献

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