膀胱尿路上皮癌中CD44v6和p63蛋白的表达及其意义

【摘要】 　　目的：探讨CD44v6和p63蛋白在膀胱尿路上皮癌中的表达及其意义。方法：应用免疫组织化学方法检测60例膀胱尿路上皮癌(BUC)和20例正常膀胱黏膜组织中CD44v6和p63蛋白的表达水平，并结合临床病理特征进行分析。结果：(1) 在BUC中，CD44v6蛋白表达阳性率为63.3%(38/60)，明显高于正常膀胱黏膜组织(30.0%，6/20，χ2=6.73，P＜0.05)。(2) 20例正常膀胱黏膜组织和60例BUC中p63蛋白染色均为阳性；BUC分化程度越低，p63阳性细胞数越多，细胞着色越深；而正常膀胱黏膜组织中仅基底层及上基层细胞p63阳性。(3) CD44v6和p63蛋白表达均与肿瘤分级、临床分期、复发和转移相关(P＜0.05)。结论：CD44v6和p63蛋白可能参与了调控BUC的发生、发展过程，其高表达预示BUC预后不良。

【关键词】 膀胱肿瘤； 尿路上皮癌； CD44v6蛋白； p63蛋白； 免疫组织化学
　　
　　[Abstract] Objective: To study the expression and clinical significance of CD44V6 and p63 in uroepithelium carcinoma of bladder(BUC). Methods: Immunohistochemical method was used to detect the expression of CD44v6 and p63 protein in 60 cases of BUC and 20 cases of normal epithelium tissues. Results: (1) The positive rates of expression of CD44v6 protein in BUC (63.3%，38/60)was significantly higher than that of normal epithelium(30.0%，6/20)(χ2=6.73，P＜0.05). (2) p63 protein was positive reaction in 20 cases of normal epithelium tissues and 60 cases of BUC.Expression of p63 strongly associated with poor differentiation of BUC.Normal epithelium tissues expressed p63 in their basal and superbasal cells. (3) In BUC expression of CD44v6 and p63 protein was correlated with tumor grade， clinical staging， recurence and metastasis (P＜0.05). Conclusions: CD44v6 and p63 protein may be closely correlated with tumor development.High expression of CD44v6 and p63 protein indicates poor prognosis．

　　［Key words］ bladder neoplasms； uroepithelium carcinoma； CD44v6 protein； p63 protein； immunohistochemistry
　　
　　膀胱尿路上皮癌(uroepithelium carcinoma of bladder， BUC)是最常见的泌尿系统恶性肿瘤，发病率在我国的泌尿系恶性肿瘤中占首位。近年来研究证明，BUC的发生、发展是一种复杂过程，与多个基因和多种分子水平变化密切相关。CD44v6是在细胞恶性转移过程中通过其结构和功能均发生显著变化而影响肿瘤细胞侵袭、转移行为的典型的细胞表面黏附分子［1-4］；p63是p53基因内家族中的一员，广泛分布于复层上皮细胞的基底层和单层上皮组织的基底细胞中，被认为是可能参与上皮组织的正常发生和分化以及形态学的发生，并可以促进肿瘤的生长［4-8］。我们应用免疫组织化学方法检测BUC和正常膀胱黏膜组织中CD44v6和p63蛋白表达情况，旨在探讨这两种基因蛋白表达与BUC的发生、发展的关系及其生物学意义。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 标本来源
　　
　　取我院2005年1月至2009年3月间手术切除并经病理诊断为BUC标本60例。其中男51例，女9例；年龄30～78岁，平均(63.89±7.45)岁。病理分级按WHO标准：G1～G2 39例，G3 21例；临床分期按TNM标准：浅表性肿瘤Tis～T1 25例，浸润性肿瘤T2～T4 35例；原发癌34例，复发癌26例；有淋巴结转移和远处转移者20例，无转移者40例。取同期距肿物1 cm以外的正常膀胱黏膜组织20例作为对照观察，标本经40 g·L-1甲醛固定，石蜡包埋，4 μm厚连续切片。
　　
　　1.2 试剂
　　
　　鼠抗人CD44v6、p63单克隆抗体和LSAB试剂盒均为丹麦Dako公司产品(均为即用型)。
　　
　　1.3 方法
　　
　　免疫组织化学染色采用微波链霉亲和素生物素(microwavelabelledstreptavidin biotin， MWLSAB)技术，即将切片常规脱蜡水化后，放入枸橼酸缓冲液(10 mmol·L-1，pH 6.0)内，用微波仪170 W辐射5 min，冷却后水洗.其他操作流程同常规LSAB法，所不同的是3步抗原孵育和正常血清封闭用微波仪130 W分别辐射5 min，然后保温2 min。实验用已知CD44v6和p63阳性宫颈癌组织作为阳性对照，用磷酸盐缓冲液(PBS)代替一抗作为阴性对照。h3O2DAB显色。
　　
　　1.4 结果判断
　　
　　免疫组织化学染色呈棕黄色为阳性。CD44v6蛋白以细胞质和细胞膜、p63蛋白以细胞核显示棕黄色颗粒为阳性。采用单盲法，每张切片在400倍显微镜下选10个视野，计算阳性细胞的百分数。未见棕黄色颗粒为阴性(-)，阳性细胞数＜25%为弱阳性，25%～75%为阳性，＞75%为强阳性。
　　
　　1.5 统计学处理
　　
　　CD44v6和p63蛋白表达阳性率比较采用χ2检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 CD44v6和P63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC中的表达

　　CD44v6蛋白阳性细胞的棕黄色染色定位于细胞质和细胞膜，背景清晰。CD44v6蛋白在正常膀胱黏膜组织中阳性细胞主要局限于黏膜上皮的基底细胞层及上基层细胞，表层细胞无表达(图1)；在BUC中阳性呈弥漫性分布，且细胞分化越低，CD44v6蛋白表达强度越强，分化高的肿瘤细胞呈弱阳性或阴性(图2)；BUC组织中CD44v6蛋白阳性表达率和强阳性表达率显著高于正常膀胱黏膜组织(χ2=6.73或χ2=14.24，P＜0.05)。

　　p63蛋白阳性细胞的棕黄色染色定位于细胞核，背景清晰，所有切片细胞均呈不同程度阳性反应。在正常膀胱黏膜组织中，p63蛋白阳性细胞主要局限于黏膜上皮的基底细胞层及上基层细胞(图3)；在BUC组织中p63蛋白主要呈强阳性表达(图4)，且细胞分化越低，p63蛋白表达强度越强，分化高的肿瘤细胞呈弱阳性或阴性；BUC组织中p63蛋白强阳性表达率显著高于正常膀胱黏膜组织(χ2=18.11，P＜0.05)。CD44v6和p63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC组织中的表达见表1。表1 CD44v6和p63蛋白在正常膀胱黏膜和BUC中的表达（略）

　　2.2 CD44v6和p63表达与BUC临床病理特征的关系

　　随着BUC病理分级和临床分期的增高及术后复发和淋巴结或远处转移，CD44v6表达的阳性率和强阳性率、p63表达的强阳性率均显著增高(P＜0.05)，见表2。表2 CD44v6和p63表达与BUC临床病理指标的关系（略）

　　3 讨论
　　
　　肿瘤的发生、发展和转移是一个多阶段，受多因素、多种基因及因子调控的复杂过程，其中任何一种基因或因子的异常表达均可导致恶性肿瘤的发生或转移。CD44属Ⅰ类膜蛋白，是一类介导细胞与细胞或细胞与细胞外基质之间产生相互黏附作用的细胞黏附分子。其在人体组织中分布极为广泛，主要参与细胞与细胞、细胞于基质之间的特异性粘连过程，从而维持组织与器官的基本结构。CD44分为2种类型，即标准型CD44(CD44s)和变异型CD44(CD44v)。基因组分析表明，变异型CD44包括CD44v1～v10，其中与肿瘤转移较为密切的是CD44v6。其促进转移作用机制可能是表达CD44v6蛋白的肿瘤细胞与淋巴管或血管内某一配体结合，使转移至那里的肿瘤细胞更加稳定地寄宿与生长，由此形成转移瘤。近年研究［1-4］证实，CD44v6蛋白和转录分子水平的过量表达与许多肿瘤的发生发展、侵袭和转移密切相关。p63基因是1998年在人类及大鼠基因组中发现的一个与p53同源的基因家族新成员，定位于3q273q29，其与p53具有十分相似的结构和功能。p63正常主要表达于许多上皮组织的基底层，对各上皮和间叶组织正常发生、分化以及形态学的发生具有重要作用，被视为可能是与生长发育相关的基因。p63基因在肿瘤中的高表达，可以抑制野生型p53的活性，阻止野生型p53诱导的细胞凋亡，以促进肿瘤的生长和发展。近年来研究发现，p63蛋白主要表达于肺鳞癌、宫颈鳞癌、皮肤鳞癌、食管癌和鼻咽癌等鳞状上皮起源的肿瘤组织中，且随着分化程度的升高而减低，并与其恶性肿瘤的侵袭转移等预后不良的生物学行为密切相关［4-7］。由于p63蛋白在腺癌组织中的表达极低或不表达，因此认为，p63蛋白的表达可能与某种程度的鳞状上皮相关性基因的表达潜能有关。近年来，有关p63蛋白在膀胱癌中的研究已见少数报道，结果提示，p63蛋白在尿路上皮的分化、细胞增殖中起一定作用，可能参与膀胱癌的发生发展，促成肿瘤的进展，p63蛋白高表达与其肿瘤的病理分级和临床分期密切相关，因此认为，p63蛋白是评估膀胱癌预后的潜在因素之一［8］。本研究结果显示，在正常膀胱黏膜组织中CD44v6和p63蛋白仅表达于基底层及上基层细胞；在BUC组织中CD44v6和p63蛋白表达阳性率分别为63.3%和100%，阳性细胞呈弥漫性分布，且主要为强阳性表达。表明CD44v6和p63蛋白主要存在于正在增殖或具有增殖能力的膀胱尿路上皮细胞中，与BUC细胞的增殖、恶性转化以及癌细胞的恶性程度密切相关，可能是BUC的早期事件。本研究将BUC病理分级、临床分期、原发癌与复发癌以及有无淋巴结和远处转移组进行了观察比较，发现随着BUC的病理分级和临床分期增高、肿瘤复发以及有淋巴结转移和远处淋巴结转移，CD44v6蛋白表达的阳性率和强阳性率及p63蛋白表达的强阳性率均随之显著性增高(P&<0.05)，提示CD44v6和p63蛋白表达越强，肿瘤细胞越具有较强的恶性增殖活性和转移能力，预示患者临床预后不良。我们认为，在临床病理活检中，检测BUC组织中CD44v6和p63蛋白表达，不仅对研究BUC的发生发展是一个较可靠的重要标志物，而且在判断肿瘤生物学行为及预测患者预后方面也是一个较可靠的、具有较大价值的参考指标。

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