IL10基因内耳局部治疗自身免疫性感音神经性聋的实验研究

　　　　 作者：陈文博，谭长强，董伟达，李玉瑾，蔡文君，郭浪，李王伟

【摘要】 　　目的：探索局部应用IL10基因与慢病毒重组载体对实验性自身免疫性感音神经性聋（ASNHL）的治疗作用。方法：采用纯化同种内耳抗原免疫豚鼠，造成ASNHL动物模型，再将重组载体分别经鼓阶、内淋巴囊和圆窗龛局部注射或渗透，观察听觉功能和内耳病理形态学变化，同时行免疫组织化学试验了解慢病毒转染和基因产物在内耳的分布。结果：治疗前后ABRⅢ波阈值的均值对比分析结果显示，各实验组局部基因治疗后均降低；治疗后各实验组组间比较差异无统计学意义。慢病毒主要转染部位是血管纹、Corti器、蜗轴小血管周围及其内淋巴囊等处。基因产物表达部位与转染部位基本相同。结论：重组载体经不同途径均可转导入内耳，并在内耳表达基因产物，对ASNHL发挥有效的治疗作用。

【关键词】 自身免疫性感音神经性聋； 基因治疗； 慢病毒载体

　　［Abstract］ Objective:To evaluate therapeutic effects of transferring recombinant replicationdefective lentiviral vector of interleukin IL10 gene with GFP marked into inner ear for locally treating experimental autoimmune sensorineural hearing loss(ASNHL) in guinea pig.Methods:Guinea pigs were immunized with 58 kD purified conspecific inner ear antigen and caused animal models of autoimmune sensorineural hearing loss.The experimental groups with recombinant therapeutic gene vectors injecting into inner ear through three approaches(tympanic scale，endolymphatic sac and round window membrane) for therapy of ASNHL.Before and after gene therapy(7 days)，auditory brainstem response (ABR) thresholds were determined，and tissue paraffin sections of temporal bone was made and observed by light microscopy and electron microscopy.Immunofluorescence and enzyme immunohistochemistry tests was made for detecting lentiviral transfection and gene product expression.Results:After treatment the mean threshold of ABR Ⅲ wave in experimental A，B，C groups lowered than that before treatment; and contrasting between these groups there were no significant difference. Lentriviras carring purpose gene mainly transferred the psalterial cord，cortiorgan，cochlear axis，vessels and endolymphatic sac，etc. Expressing parts of gene product and thansfering parts were generally the same.Conclusion:Recombinant replication defective lentiviral vector can transfer into inner ear through different approaches and generate gene product，and shows therapeutic effect to ASNHL.

　　［Key words］ autoimmunity sensorineural hearing loss; gene therapy; lentiviral vector
　　
　　1979年McCabe通过对部分感音神经性聋患者的临床观察［1］，首先提出自身免疫性感音神经性聋这一概念（autoimmune sensorineural hearing loss，ASNHL），之后许多相关专家和学者对该病进行了大量的实验与临床研究，现已证实，ASNHL是一种临床疾病实体。作为目前极少数可以获得有效治疗的感音神经性聋（SNHL）之一，对其进一步研究工作已成为耳科学领域的一个热点。
　　
　　自1996年基因治疗应用于内耳，基因疗法被认为是未来治疗听力障碍最有希望的方法之一［2-3］。目前ASNHL治疗方面存在以下问题：激素和免疫抑制剂虽然有效，但需应用较长的时间，可造成不同程度的毒副作用；部分患者听力改善达到一定水平后，继续用药疗效甚微。基因治疗具有一次注射、长期有效的特点，而且内耳解剖结构特点非常适合进行局部基因治疗。本项目组在前期实验研究中已采用腺病毒与白介素10（IL10）和Fasl基因构建重组载体，对ASNHL模型动物进行试验性治疗，证实具有显著的治疗效果［4］。本次实验采用IL10基因与慢病毒构建重组载体，经不同途径导入内耳，旨在进一步证实局部应用免疫调节基因对ASNHL的治疗效果以及不同导入途径的疗效和安全性，以期探索一种高效、安全和简便的ASNHL内耳局部基因治疗方法。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 实验动物
　　
　　选择白毛、红眼、健康、3月龄豚鼠（雌雄不限），体重250～300 g，耳廓反射正常，耳镜检查排除中耳疾患。所用动物由南京市青龙山实验动物繁殖场提供。
　　
　　1.2 纯化内耳抗原（purified inner ear antigen，PIEAg）的制备

　　将豚鼠清醒断头，取出听泡，在解剖显微镜下分离膜迷路组织［包括基底膜、螺旋韧带、膜半规管、椭圆囊和球囊（去除耳石器）］，置于0.1 mol·L-1 pH 7.4磷酸盐缓冲液（PBS）中，经研磨、冻溶、超声粉碎、匀浆、离心（1 000 r·min-1，5 min）后取上清液，采用紫外分光光度计测定蛋白含量［5］。采用非变性凝胶电泳进行蛋白分离，参照标准蛋白，切取58 kD条带［6］。将膜迷路组织粉碎、匀浆，制成纯化内耳抗原备用。
　　
　　1.3 ASNHL动物模型制备
　　
　　将80只豚鼠采用PIEAg免疫。首次将PIEAg凝胶匀浆液0.2 ml与等量完全弗氏佐剂（Sigma公司，美国）乳化后，注射于豚鼠右后足垫和背部多点皮下，以后每隔2周，采用首次抗原用量的一半与等量不完全弗氏佐剂注射，作为强化免疫，共2次［7］。
　　
　　末次免疫后2周，听觉脑干诱发电位（auditory brainstem response，ABR）Ⅲ波阈值升高（以免疫前全部动物均值加2倍标准差作为判断标准）并出现针对PIEAg特异性抗体（ELISA法，波长490 nm A值，以免疫前全部动物均值加2倍标准差作为判断标准）的豚鼠被判断为ASNHL模型动物。本组建模成功36只。
　　
　　1.4 实验分组
　　
　　36只ASNHL模型动物按配对设计分成6组：实验组分A、B、C亚组，对照组分D、E、F亚组，每组6只。全部动物手术操作均在全身麻醉下进行，麻醉方法为3%的戊巴比妥钠30 mg·kg-1腹腔注射。手术过程实行无菌操作。
　　
　　A组采用鼓阶内注射法：在右耳廓后上方1.5～2 cm弧形切口，暴露听泡。用微型电钻在听泡上钻一直径约0.5 cm的圆孔，暴露耳蜗底转。用针尖轻轻磨薄耳蜗鼓阶侧壁的骨壁，钻一针尖大小的孔，用微推进器将小儿头皮针的针尖（针尖斜面已打磨变小）刺穿骨膜及螺旋韧带，插入鼓阶，深度不超过1 mm，先抽取少量（约10 μl）的外淋巴液，再通过微量注射泵缓慢（以 0.75 μl·min-1的速率匀速注入5 μl）注入治疗基因。完毕后，退出针头，迅速用骨蜡封闭小孔，以防止外淋巴液和治疗基因流出。抗生素冲洗中耳腔3次，部分局部放置氧氟沙星明胶海绵预防感染。再用明胶海绵和骨蜡封闭听泡骨孔。然后逐层缝合切口。
　　
　　B组采用圆窗龛局部置药法：手术方法同上，暴露听泡腔后，看清圆窗龛，把浸有携带目的基因慢病毒载体液（40 μl）的明胶海绵贴放在圆窗龛局部。
　　
　　C组采用内淋巴囊注射法：经内淋巴囊途径注入治疗基因。豚鼠麻醉后，耳廓后上方皮肤切口，分离皮下和肌肉，暴露枕骨后面，采用枕骨后凹进路，切削钻头磨开枕骨的颅骨后凹骨质，分离和推开硬脑膜和乙状窦，暴露内淋巴囊，内淋巴囊部位注入5 μl慢病毒载体液。骨蜡填充骨质缺损，充分止血后缝合皮肤。
　　
　　D、E、F为模拟手术对照组，均注入PBS。操作方法：D组同A组，E组同B组，F组同C组。
　　
　　1.5 观察指标

　　1.5.1 血清特异性抗体测定

　　分别于免疫前、末次免疫后2周和慢病毒载体液局部注射治疗后2周心脏采血，分离血清，采用酶联免疫吸附分析法（enzymelinked immunosorbent assay，ELISA）检测针对PIEAg的特异性抗体水平。方法为分别采用100 μg·ml-1 PIEAg凝胶匀浆液100 μl·孔-1包被ELISA板，4 ℃过夜，PBSTween20洗板3次，每次5 min，分别加入用PBS 1∶10稀释的各相应组受试动物血清，100 μl·孔-1，封闭，37 ℃下孵育2 h，洗涤同前；加入1∶2 000稀释的辣根过氧化物酶标记山羊抗豚鼠IgG（Sigma公司，美国）多克隆抗体，100 μl·孔-1，37 ℃孵育1 h，PBSTween20洗板；以TMB为底物37 ℃显色10 min，用2 mol·L-1 h3SO4终止反应，用酶联免疫检测仪测定490 nm波长吸光度（A）值。

　　1.5.2 ABR测试

　　分别于免疫前、末次免疫后2周和基因治疗后采用电反应测听系统行ABR测试。方法为用1%的戊巴比妥钠（30 mg·kg-1）予豚鼠腹腔注射进行全麻，置隔声屏蔽室内，采用针形电极插入豚鼠头顶冠状缝与矢状缝交界处作为测试电极，参考电极置于耳廓后方靠近乳突尖，接地电极置于对测乳突，采用click作为刺激声信号，刺激重复率为11次·s-1，带通滤波为100～3 000 Hz，叠加2 048次，记录各波反应阈值、潜伏期和波幅。

　　1.5.3 内耳火棉胶切片光镜观察

　　豚鼠末次听觉电生理检查后，每组各取豚鼠2只，立即断头，取出双侧颞骨，修整后浸泡福尔马林固定24 h，10%乙二胺四乙酸（ethylene diamine tetraace ticacid，EDTA）脱钙，浸泡硫酸锂24 h（防止组织膨胀），逐级酒精脱水和浸胶，火棉胶定向包埋和修块后，水平切片机切片（片厚20～25 μm），每一耳蜗取靠近蜗轴的3张切片，保存于70%酒精，HE染色后光镜观察［9-10］。

　　1.5.4 免疫组织化学试验

　　于末次听觉测试后，各组取豚鼠4只，麻醉、断头，迅速取颞骨，打开听泡，放置4%多聚甲醛固定液中，用针挑开圆窗，在蜗尖钻一小孔，快速灌注数次，固定12 h，采用EDTA脱钙7～10 d，修剪后流水冲洗1～2 h，常规脱水、透明、浸蜡、定向包埋。行耳蜗中轴切片，片厚5 μm。
　　
　　（1） 酶免疫组织化学试验：每组各2只动物，取切片，用胰酶（0.2%）修复抗原，正常山羊血清封闭10 min，加PBS稀释的一抗（兔抗鼠IL10，），4 ℃过夜，PBS洗5 min，共3次，加入二抗（辣根酶标记的山羊抗兔IgG），37 ℃孵育30 min，PBS洗5 min，共3次，DAB染色，封片剂封片，光学显微镜观察摄片。以上试剂购买自武汉博士德生物工程有限公司。
　　
　　（2） 荧光组织化学法：每组各取2只动物的颞骨蜡块，行耳蜗中轴切片，片厚5 μm，漂片、捞片、粘片后常规脱蜡至水，在倒置荧光显微镜下直接观察和摄片。
　　
　　1.6 统计学处理
　　
　　经正态性检验，各组血清中PIEAg的特异性抗体水平（A值）、ABR Ⅲ波阈值的结果符合正态分布，所得数据以x-±s表示，应用SPSS 13.0软件对数据进行统计分析，P&<0.05为差异具有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 特异性免疫反应试验结果
　　
　　见表1。表1 免疫前后及基因治疗后各组血清中PIEAg特异性抗体水平（略）
　　
　　结果显示：与免疫前相比，各实验组和对照组免疫后抗体水平均明显升高，差异均有统计学意义（配对t检验，P＜0.05）。免疫前和免疫后的各组间比较，PIEAg水平差异无统计学意义（配对t检验，P＞0.05）。各组治疗后与免疫后相比，未见显著性差异（配对t检验，P＞0.05）。
　　
　　2.2 听觉功能
　　
　　见表2。表2 各组免疫前后及局部治疗后右耳ABR Ⅲ波阈值（dB，peSPL）（略）
　　
　　与免疫前相比，免疫后各组ABR平均阈值升高，差异均有统计学意义（t检验，P＜0.05）。与内耳抗原免疫后相比，实验A组、B组和C组内耳局部基因治疗后ABR平均阈值降低，差异亦均有统计学意义（t检验，P＜0.05）；A组、B组、C组的组间比较差异无统计学意义（t检验，P﹥0.05）。对照组内耳局部给药前后比较，ABR平均阀值差异无统计学意义。

　　各组内同期左右耳比较，ABR平均阈值差异均无统计学意义（t检验，P﹥0.05）。以各组免疫后的ABR平均阈值减2倍标准差作为判断听觉功能改善标准，实验A组有4耳、B组有3耳、C组有2耳（均为慢病毒载体注射耳）听觉功能明显提高，治疗有效率分别为67%（4耳/6耳）、50%（3耳/6耳）、33%（2耳/6耳）；对照组内耳局部给药后，未发现有明显听力功能提高。
　　
　　2.3 内耳光镜观察结果
　　
　　见图1～3。各对照组均可见不同程度的膜迷路积水（图1A，图1B），螺旋神经节和蜗轴小血管周围有炎症细胞、淋巴细胞浸润，部分听损耳还可见螺旋神经节细胞数目减少（图1C）。

　　2.4 免疫组织化学试验

　　2.4.1 免疫荧光试验

　　荧光显微镜观察，实验A组和B组荧光主要显示部位基本一致（A组：血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B组：螺旋神经节、螺旋韧带、Corti器、血管纹，蜗轴小血管周围前庭膜）；C组荧光主要显示部位为内淋巴囊、内淋巴管、前庭囊斑、壶腹嵴等处。对照组均未见明显荧光积聚。

　　2.4.2 酶免疫组织化学

　　酶免疫组织化学观察结果显示各组实验耳基因产物表达部位：A组为血管纹、螺旋韧带、Corti器、螺旋神经节、蜗轴小血管周围；B组为螺旋神经节、螺旋韧带、Corti器、血管纹，蜗轴小血管周围前庭膜等处；C组为内淋巴囊、内淋巴管、前庭囊斑、壶腹嵴等处。
　　
　　3 讨论
　　
　　目前临床ASNHL患者几乎均采用传统自身免疫病治疗方法，即采用皮质激素或免疫抑制剂治疗［11］，虽然疗效较快、较好，但该类药物毒副作用多，而且还存在停药后复发率较高等问题。与传统的治疗方法相比，基因治疗具有高效性和靶向性、一次注射长期发挥疗效等优点。内耳的解剖特征，即存在相对独立和封闭的腔隙，非常适合局部注射和基因治疗。现有的研究表明，基因治疗在听力损伤和平衡障碍的治疗方面有较大的潜在应用价值，目前内耳基因治疗正从试验可行性研究转向内耳安全导入的探索上。
　　
　　随着对疾病分子机制认识的加深及生物技术的发展，用于基因治疗的载体系统可分为病毒性载体和非病毒性载体两类［12］。慢病毒载体与简单的逆转录病毒载体相比，具有可感染分裂细胞及非分裂细胞、容纳外源性目的基因片段大，目的基因表达时间长、不易诱发宿主免疫反应等优点，已成为当前基因治疗中载体研究的热点，在基因治疗中具有广泛的应用前景。
　　
　　载体进入体内的途径是决定安全有效基因治疗的一个主要因素，耳蜗基因治疗必需确保转染基因精确、有效定位于靶器官，以提高转染效率，降低易变性。目前介导病毒载体进入耳蜗的方法有耳蜗切开、通过圆窗注人、耳蜗底回钻孔注入、内淋巴囊注入［13］、微渗透泵和通过脑脊液［14］等不同的进路。理想的导入模式是载体能均匀地分布到内耳各个部位并转染特异性细胞。
　　
　　本项目设计利用内耳解剖特点和慢病毒载体的诸多优势，采用慢病毒与免疫调查基因构建重组载体内耳局部给药。同时考虑到由于耳蜗位置深在，结构复杂，采用了圆窗龛局部给药这一较为便捷、安全和具有临床应用前景的给药途径，探讨重组基因载体经圆窗膜渗透和导入内耳的实际疗效，并与内耳直接注射和经内淋巴囊注射给药疗效的对比分析，了解其应用价值和意义。
　　
　　本次实验结果显示，采用纯化豚鼠内耳组织58kD抗原免疫豚鼠，可成功制作ASNHL的动物模型。免疫组织化学试验结果证实，3种给药途径（中耳腔给药经圆窗膜渗透、鼓阶内注射和内淋巴囊局部注射）均可将携带IL10的慢病毒载体转导入内耳，并在内耳表达基因产物（IL10）。听觉功能试验结果证实，3种给药途径均可有效改善豚鼠的听力，手术本身并不明显影响听力。鼓阶和圆窗途径转染部位相似。圆窗途径组织损伤轻，能保持耳蜗的自然解剖结构。内淋巴囊接种载体到达范围广，可有效地转染经鼓阶不易达到的部位，该途径可能具有较特殊的应用价值，但操作较为复杂。鉴于鼓阶途径有损伤听力的风险，而中耳腔圆窗途径治疗因其简单易行，故有较好的应用前景。

参考文献

　　［1］MCCABE B F.Autoimmune sensorineural hearing loss［J］.Ann Otol Rhinol Laryngol，1979，88(5 Pt 1):585589.

　　［2］LALWANI A K，Walsh B J，Reilly P G，et al.Development of in vivo gene therapy for hearing disorders:introduction of adenoassociated virus into the guinea pig［J］.Gene Ther，1996，3(7):58892.

　　［3］RAPHAEL Y，FRISANCHO J C，ROESSLER B J.Adenoviralmediated gene transfer into guinea pig cochlear cells in vivo［J］.Neurosci Lett，1996，207(2):13741.

　　［4］蔡文君，谭长强.自身免疫性感音神经性聋基因治疗的实验研究［J］.东南大学学报：医学版，2009，28(2)：7984.

　　［5］陆玲，谭长强.致自身免疫性梅尼埃病主要内耳抗原成份分析研究［J］.中华耳鼻咽喉头颈外科杂志，2008，43(8)：596600.

　　［6］李玉瑾，谭长强.纯化内耳组织抗原免疫致豚鼠自身免疫性梅尼埃病的实验研究［J］.东南大学学报：医学版，2009，28(3)：157162.

　　［7］谭长强.特异性体液转移免疫致豚鼠先天性感音神经性聋实验研究［J］.东南大学学报：医学版，2007，26(5):327332.

　　［8］TAN C Q，DONG W D，GUO L，et al.Auditory function in women with autoimmune inner ear diseases and their offspring［J］.Int J Pediatr Otorhinolaryngol，2009，73(12):17021711.

　　［9］谭长强，周红，卜行宽，等.同种内耳抗原免疫致聋豚鼠的子代内耳生理功能和病理形态学研究［J］.中华耳鼻咽喉科杂志，2005，40(1):2226.

　　［10］谭长强，董伟达，陆玲.同种内耳抗原免疫孕豚鼠所产子鼠听觉损伤程度与母鼠特异性免疫反应水平相关性研究［J］.东南大学学报：医学版，2007，26(6):397402.

　　［11］MCCABE B F.Autoimmune inner disease［M］//PAPARELLA M M，MEYERHOFF W L.Clinical Otology.Baltimore:William′s &&Wilkins，1983:137.

　　［12］李永团，董频.基因转移在内耳的应用进展［J］.山东大学基础医学院学报，2003，17(3)：180183.

　　［13］YAMASOBA T，YAGI M，ROESSLER B J，et al.Inner ear transgene expression after adenoviral vector inoculation in the endolymphatic sac［J］.Hum Gene Ther，1999，10(5):769774.

　　［14］STVER T，YAGI M，RAPHAEL Y.Transduction of the contralateral ear after adenovirusmediated cochlear gene transfer［J］.Gene Ther，2000，7(5):377383.