表面修饰对氧化铁纳米粒子类酶活性的影响

　　　　　　 作者：杨婷，吴沂航，张晓庆，张宇，顾宁

【摘要】 　　目的：研究表面修饰对氧化铁纳米粒子类酶活性的影响。方法：用共沉淀法制备γFe2O3纳米粒子，并用透射电子显微镜（TEM）表征。将γFe2O3纳米粒子分别表面修饰二巯基丁二酸（DMSA）、柠檬酸、酒石酸和3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS），并用Zeta电位仪表征。由于γFe2O3纳米粒子可以催化双氧水氧化底物3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB），从而发生显色反应，这一特性与辣根过氧化物酶（HRP）相似，通过岛津UV3600紫外可见分光光度计和酶标仪检测该显色反应，评估氧化铁纳米粒子的催化性能及表面修饰的影响。结果：（1） TEM和Zeta电位测量表明，γFe2O3纳米粒子直径约为13 nm，表面修饰能够有效调控其表面电荷；（2） 氧化铁纳米粒子类过氧化物酶催化活性与纳米粒子的表面电荷相关，表面负电荷有利于增加对带正电荷底物TMB的亲和力，从而增加类酶活性；（3） γFe2O3/DMSA具有最高的表面负电荷，米氏常数测量表明Km（TMB）为0.3 mmol·L-1，表现出与天然HRP对底物TMB类似的亲和力。结论：通过表面修饰可以调控氧化铁纳米粒子的类酶活性，其作为HRP模拟酶具有潜在的应用价值。

【关键词】 氧化铁纳米粒子； 表面修饰； 辣根过氧化物模拟酶

　　［Abstract］ Objective:To investigate the effect of surface modifications on the peroxidaselike activity of iron oxide nanoparticles.Methods:Magnetic iron oxide nanoparticles were prepared by coprecipitation method.The morphology of particles was observed by using TEM.The obtained γFe2O3 nanoparticles were modified with meso2，3Dimercaptosuccinic acid（DMSA），citric acid，tartaric acid and 3aminopropyltriethoxysilanes(APTS)，respectively，and the resultant products were characterized by zeta potential measurements.Like horseradish peroxidase（HRP），γFe2O3 nanoparticles were found to be able to catalyze a colour reaction of the substrate 3，3′，5，5′tetramethylbenzidine(TMB) in the presence of h3O2.The catalysis was evaluated by detecting the colour reaction using UVvisible spectrophotometer and microplat reader.Results:(1) TEM measurements showed that the mean diameter of γFe2O3 nanoparticles was 13 nm.(2) The peroxidaselike activity of γFe2O3 nanoparticles was found to be related to their surface charge.TMB carries two amine groups，likely yielding stronger affinity toward a negatively charged nanoparticle surfaces.（3）γFe2O3/DMSA nanoparticles with the strongest negative surface charge exhibited the highest peroxidaselike activity than others when TMB acts as a substrate.The kinetic parameter of γFe2O3/DMSA nanoparticles were determined to be Km（TMB）=0.3 mmol·L-1，exhibiting a similar enzyme activity to the natural HRP.Conclusions:The peroxidaselike activity of γFe2O3 nanoparticles can be readily regulated by surface modifications，thus providing a potential advantage for application as a HRP mimic enzyme.

　　［Key words］ iron oxide nanoparticles; surface modification; HRP mimic enzyme
　　
　　磁性氧化铁纳米粒子因其具有多种独特的功能，在生物、医学、化学等领域受到广泛的关注。同一种磁性氧化铁纳米材料可以作为磁共振成像对比剂［1-3］、磁靶向药物载体［4］，可以用于细胞与生物分子分离［5］、生物传感与检测［6］，还可以作为磁感应肿瘤热疗的磁介质［7］。另外，在工业废水处理方面，磁性氧化铁纳米粒子因具有较高的有机物羟基化的活性而用于苯酚等有毒物质的清除（苯酚等有机物羟基化后毒性降低）［8］。在氧化铁磁性纳米粒子的应用方面，一个体系内同时发挥其多种功能的研究，是目前更具有发展前景的工作。
　　
　　过氧化物酶是广泛存在于生物体内的一类氧化还原酶，通过其内部的变价铁元素以及外部结构能催化h3O2氧化氢供体底物。在生命活动过程中，过氧化物酶主要是催化生物体内的氧化物或过氧化物氧化分解其他毒素。目前广泛应用的过氧化物酶是从天然植物中提取的辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)。HRP价格昂贵，且保存及实验条件苛刻，容易失活，在酶联免疫分析上因其分子较大而不利于抗原抗体结合，并且标记过程复杂。因此，寻找能够替代HRP的模拟酶是酶催化反应的热点［9-10］。
　　
　　在众多酶模拟物中，Fe3O4磁性纳米粒子最近被发现能像Fenton试剂一样，表现出一定的类过氧化物酶活性，由此结合磁分离功能，能够发展可同时进行磁分离富集和免疫检测的方法［11］。由于Fe3O4纳米粒子稳定性好、制备方法简单、成本低、易于大规模制备，同时还兼具有磁性等其他多功能特性，因此在医学、生物技术、环境化学等领域有广泛的应用价值。γFe2O3是另外一种磁性较强的氧化铁纳米粒子，可由Fe3O4纳米粒子直接氧化而来。由于γFe2O3磁性纳米粒子中只含有三价铁，因此，相对于Fe3O4纳米粒子来说不易被氧化，具有良好磁学和化学稳定性。但是由于γFe2O3磁性纳米粒子中缺乏二价铁，其本身类酶活性大大降低，从而严重限制了其作为模拟酶的应用。作者通过表面修饰，提高γFe2O3磁性纳米粒子类酶活性，从而得到一类稳定的、具有过氧化物酶活性的磁性γFe2O3纳米粒子。
　　
　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂
　　
　　3氨丙基三乙氧基硅烷（APTS）及3，3′，5，5′四甲基联苯胺（TMB）购自SigmaAldrich公司（美国）。30%h3O2、醋酸钠及冰醋酸购自国药集团化学试剂有限公司。FeCl3·6h3O、FeSO4·7h3O、二巯基丁二酸（DMSA）、柠檬酸及酒石酸购自上海凌峰化学试剂有限公司。
　　
　　1.2 实验方法

　　1.2.1 γFe2O3纳米粒子的制备和小分子配体修饰

　　γFe2O3磁性纳米粒子的制备及表面有机小分子修饰采用我们先前报道［12-13］的方法。（1） γFe2O3磁性纳米粒子的制备［12］。在N2保护下制备Fe3+（FeCl3·6h3O，0.2 mol·L-1）和Fe2+（FeSO4·7h3O，0.13 mol·L-1）的混合溶液800 ml，将2.8 mol·L-1的氨水在剧烈的磁力搅拌下缓慢加入其中，直至pH=9，反应1 h，生成黑色沉淀，将生成物用永磁铁分离出来，反复用去离子洗涤4遍。将制备得到的Fe3O4产物定容到6 L，用HCl（0.2 mol·L-1）调节溶液pH值到3.0，待pH值稳定后水浴升温到90 ℃，鼓入过滤的空气进行氧化（90 min），从而得到γFe2O3纳米粒子。通过磁分离方法反复洗涤4遍后，定容约1 g·L-1，调pH=2.7。（2） γFe2O3/DMSA磁性纳米粒子的制备［12］。称取60.69 mg DMSA，用DMSO溶解，机械搅拌下加入到400 ml γFe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h，停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（3） γFe2O3/柠檬酸磁性纳米粒子的制备［13］。称取52.6 mg柠檬酸，用10 ml去离子水溶解，机械搅拌下加入到400 ml γFe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（4） γFe2O3/酒石酸磁性纳米粒子的制备［13］。取37.6 mg酒石酸，用10 ml去离子水溶解，机械搅拌下加入到400 ml γFe2O3磁性纳米粒子样品中，继续搅拌5 h停止反应，磁分离洗涤沉淀物3次，加80 ml去离子水定容，用四甲基氢氧化铵调pH=6.5。（5） γFe2O3/APTS磁性纳米粒子的制备［12］。取800 ml γFe2O3磁性纳米粒子样品，用无水乙醇磁分离洗涤3次，定容至600 ml，充分超声。之后机械搅拌下在该反应体系中加入0.5 ml APTS，半小时后加去离子水100 μl，继续搅拌3.5 h。停止反应后用无水乙醇磁分离洗涤沉淀物3遍，去离子水洗涤3遍，定容到160 ml，盐酸调pH=3.85。

　　1.2.2 小分子配体修饰的γFe2O3纳米粒子的表征

　　（1） 原子吸收测定Fe浓度：上述5个样品各取100 μl，分别加1 ml浓盐酸静置12 h，充分反应将氧化铁纳米粒子溶解为铁离子，再用去离子水定容至10 ml，待测。仪器型号为18080（日本Hitachi公司）。最终样品统一定浓度为2.3 g·L-1。（2） 透射电镜（TEM）表征：将γFe2O3样品用去离子水稀释后，滴1滴于TEM专用铜网上，40 ℃下真空烘干8 h，待测。仪器型号为JEM200EX。（3） Zeta电位仪表征不同小分子对γFe2O3纳米粒子的修饰情况：将上述5个样品去离子水充分洗涤除去溶液中电解质，定容后待测。仪器型号为ZetaMaster3000。
　　
　　1.3 小分子配体修饰的γFe2O3纳米粒子的类过氧化物酶催化性能研究

　　1.3.1 Fe3O4、γFe2O3/DMSA和γFe2O3纳米粒子的催化能力比较

　　各个反应体系中，在石英比色皿内，分别取34 μg磁性纳米粒子，溶于1 ml醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入50 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO）和160 μl的30%h3O2。用岛津UV3600紫外可见分光光度计测得显色反应10 min后的吸收光谱图。

　　1.3.2 不同配体修饰γFe2O3纳米粒子的催化能力比较

　　在各个反应体系中，分别取6.77 μg不同有机分子修饰的γFe2O3磁性纳米粒子，溶于200 μl醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入10 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO）和32 μl的30%h3O2。在BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收值，扫描时间为1 200 s，反应温度为25 ℃。

　　1.3.3 γFe2O3/DMSA纳米粒子的米氏动力学实验研究

　　（1） TMB的米氏常数测定。取6.77 μg γFe2O3/DMSA磁性纳米粒子，溶于200 μl醋酸钠缓冲溶液（pH 4.6）中，加入13 μl的30%h3O2，分别加入不同量（0.2、0.4、0.8、1.6、2.4、3.2、4.0 μl）的TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO），BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收值，扫描时间120 s，反应温度25 ℃。实验重复3次取数据。（2） h3O2的米氏常数测定。取6.77 μg γFe2O3/DMSA磁性纳米粒子，溶于200 μl醋酸钠缓冲溶液（pH4.6）中，加入5 μl TMB溶液（10 mg·ml-1，溶于DMSO），分别加入不同量（0.7、1.3、2.6、5.2、7.8、10.4、13.0 μl）的30%h3O2，在BIORAD 680酶标仪检测650 nm下的光吸收值随时间变化，反应温度25 ℃。实验重复3次取数据。

　　2 结果与讨论
　　
　　图1（A）是γFe2O3纳米粒子的TEM照片，图1（B）是由图1（A）统计出的γFe2O3纳米粒子的粒径分布。从图1中可以看出γFe2O3纳米粒子接近球形，平均粒子直径为13 nm。
　　
　　通常纳米粒子表面的修饰，可以达到以下目的：(1) 改善或改变纳米粒子的分散性；(2) 提高粒子表面活性；(3) 使粒子表面产生新的物理、化学、机械性能及新的功能；(4) 改善纳米粒子与其他物质之间的相容性。对氧化铁纳米粒子进行表面修饰可以增加其性能［14］。
　　
　　为了对比配体修饰对γFe2O3纳米粒子催化活性的影响，我们分别用DMSA、柠檬酸、酒石酸及APTS对γFe2O3纳米粒子进行表面修饰，各小分子结构式见图2（A），结合图2（B）可知，修饰后氧化铁纳米粒子的表面电荷从负到正顺序为γFe2O3/DMSA的平均表二巯基丁二酸修饰的γFe2O3纳米粒子（γFe2O3/DMSA）具有最高的表面负电荷是由于表面修饰过程中分子间形成了二硫键，导致二巯基丁二酸会以几聚体的形式化学吸附（通常是羧基或巯基与粒子表面铁原子形成配位键）到粒子表面，提供了更多的剩余羧基（—COOH）裸露在外面，在pH＞3的条件下解离为带负电的羧基阴离子（—COO-），从而使纳米粒子表面荷更多的负电荷［15］。对于柠檬酸和酒石酸的情况，由于柠檬酸比酒石酸多一个羧基，因而表面电荷较酒石酸偏负。APTS分子是一个双功能硅烷偶联剂，三乙氧基硅烷端很容易与γFe2O3纳米粒子表面上的羟基（—OH）发生硅烷化反应，另一端的氨基裸露在外面，在中性或酸性条件下均可质子化，从而提供了磁性纳米粒子的表面正电荷［12］。对于表面未修饰的γFe2O3纳米粒子，在酸性条件下，表面羟基质子化，同样导致了表面较高的正电荷。

　　图3显示了Fe3O4、γFe2O3及γFe2O3/DMSA纳米粒子催化双氧水氧化TMB显色反应的紫外可见分光光度计测得的吸光谱图。650 nm处是考察催化能力的特征吸收峰，即TMB氧化产物的吸收峰。在反应10 min的时候，Fe3O4纳米粒子组的特征峰吸收值达到3.166；γFe2O3纳米粒子的催化能力很弱，只能达到0.419；而通过表面修饰，γFe2O3/DMSA组的特征峰吸收值可以达到1.67；空白对照组是指不加催化剂条件下单纯的双氧水氧化TMB，可以看到反应很缓慢，10 min的时候几乎见不到特征吸收峰。这说明与Fe3O4纳米粒子比较，由于γFe2O3纳米粒子中亚铁离子的缺乏，使其催化能力变得很弱，当通过表面修饰DMSA后，其催化能力明显提高。
　　
　　图4是不同配体修饰γFe2O3纳米粒子催化双氧水氧化TMB反应的对比示意图。可以看出，在催化反应15 min的时候，催化能力的强弱是：γFe2O3/DMSA＞γFe2O3/柠檬酸＞γFe2O3/酒石酸＞γFe2O3/APTS＞裸γFe2O3。结合氧化铁纳米粒子修饰后表面电荷的数据，可知氧化铁纳米粒子表面电荷越偏负电，越有利于催化反应。这与底物TMB是多氨基的化学物质有着紧密的关系，其在酸性缓冲反应体系中质子化而带正电荷，因此，表面荷负电荷越多的氧化铁纳米粒子越有利于吸附底物TMB，即具有更高的底物亲和力，从而有利于加速双氧水氧化TMB的反应。对于表面荷正电荷的氧化铁纳米粒子，由于表面和底物之间的排斥力，从而降低了催化效率。可见，通过合理的表面修饰，可以有效地调控氧化铁纳米粒子的类酶活性。由于纳米粒子表面易于修饰和裁剪，因此为方便地调控这种模拟酶活性以及进一步的偶联抗体等生物分子提供了保证。
　　
　　为了更进一步的研究γFe2O3/DMSA纳米粒子的模拟酶催化反应的机制，我们对其表观稳态动力学参数Km进行了测定(图5)。Km值是酶的特征性常数，只与酶的性质、酶所催化的底物和酶促反应条件(如温度、pH、有无抑制剂等)有关，与酶的浓度无关。酶的种类不同，Km值不同，同一种酶与不同底物作用时，Km值也不同。各种酶的Km值范围很广，大致在10-1～10-6 mol·L-1之间。Km值愈大，酶与底物的亲和力愈小；Km值愈小，酶与底物亲和力愈大。酶与底物亲和力大，表示不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度［14］。
　　
　　因为反应体系的氧化产物的浓度与检测到的吸光度成正比，所以吸光度的变化速率与产物的生成速率成正比，即与体系的反应速率成正比。对酶催化反应速度和对应底物浓度，采用双倒数法作图，可求得γFe2O3/DMSA纳米粒子模拟酶对各底物的Km。当以h3O2为底物时，γFe2O3/DMSA纳米粒子对应的Km为176.84 mmol·L-1；而以TMB为底物，γFe2O3/DMSA纳米粒子对应的Km为0.30 mmol·L-1。文献中辣根过氧化物酶的Km（h3O2）为3.7 mmol·L-1，Km（TMB）为0.43 mmol·L-1［11］。这说明以h3O2为底物，Fe3O4纳米粒子对应的Km比HRP要高，即为了获得最大反应速度，需要较高浓度的氧化剂h3O2；而以TMB为底物，γFe2O3/DMSA纳米粒子对应的Km比HRP要低，说明相对于HRP，γFe2O3/DMSA纳米粒子对底物TMB具有更高的亲和力，即不需要很高的底物浓度，便可容易地达到最大反应速度。
　　
　　通过以上结果可知，对磁性γFe2O3纳米粒子的表面修饰可以改变磁性γFe2O3纳米粒子作为模拟酶的活性，这提供了一种裁剪和优化模拟酶活性和功能的方法，不仅能改善类酶活性，还能进一步增加纳米粒子稳定性和生物相容性，此外其提供了表面进一步偶联生物分子的功能基团，有利于标记蛋白、核酸等生物分子，使其很有潜力成为HRP的模拟酶用于生物检测的实际应用。

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