BMSCsPluronic F127水凝胶复合体移植治疗椎间盘退变的实验研究

　　　　 作者：李果，吴小涛，王运涛，樊守刚，王锋

【摘要】 　　目的：探讨兔BMSCsPluronic F127凝胶复合体移植治疗椎间盘髓核缺损退变的效果，为临床应用提供实验依据。方法：6只1月龄健康新西兰白兔，雌雄不限，各取骨髓2 ml，分离培养BMSCs。取第3代骨髓间充质干细胞（BMSCs），与Pluronic F127水凝胶混匀，制备成BMSCsPluronic F127水凝胶复合体。将18只新西兰大白免建立椎间盘髓核缺损退变动物模型，并随机分为3组(n=6)。正常对照组仅分离暴露椎间盘，不作任何处理；移植治疗组将25 μl BMSCsPluronic F127水凝胶复合体注入缺损椎间盘中心；缺损退变组仅注射入0.01 mol·L-1PBS液25 μl。8周后处死动物，取出脊柱，应用MRI测量各椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度，计算信噪比；取出相应椎间盘行阿尔辛蓝过碘雪夫(ABPAS)染色及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色，切片行灰度值测定和分光光度计测定蛋白多糖含量。结果：3组椎间盘信噪比差异有统计学意义(P＜0.05)。ABPAS染色显示，正常对照组及移植治疗组椎间盘染色明显，椎间盘结构清晰；缺损退变组椎间盘结构紊乱，髓核组织和外周纤维化分界不清。移植治疗组Ⅱ型胶原和蛋白多糖的含量明显高于缺损退变组(P＜0.05)，但与正常对照组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。结论：兔BMSCssPluronic F127水凝胶复合体可修复椎间盘缺损退变，本研究为临床应用可注射式组织工程髓核移植治疗椎间盘退变奠定了实验基础。

【关键词】 水凝胶； 组织工程； 椎间盘； 骨髓间充质干细胞
　　
　　[Abstract] Objective: To investigate the therapeutic effect of BMSCsPluronic F127 hydrogel complex transplantation on intervertebral disc degeneration and to provide experimental basis for its clinical application.Methods: Two milliliter of bone marrow from 6 healthy onemonthold New Zealand rabbits were selected to isolate and culture BMSCs. Then， BMSCs at passage 3 were mixed with Pluronic F127 hydrogel to prepare BMSCsPluronic F127 hydrogel complex. Eighteen rabbits were selected to establish the model of intervertebral disc degeneration and pided into 3 groups randomly(n=6 per group): control group in which intervertebral disc was separated and exposed but without further processing; transplantation group in which 25 μl of autogenous BMSCsPluronic F127 hydrogel complex was injected into the center of defected intervertebral disc; degeneration group in which only 25 μl of 0.01 mol·L-1 PBS solution was injected. Animals were killed 8 weeks later and the repaired discs were obtained. The changes of the intervertebral disc signalnoise ratio were showed by MRI and the proteoglycan was quantitated by spectrophotometer to observe the repair effect.The collagenaseⅡ expression was detected by immunohistochemistry. Results: The signalnoise ratio had a significant difference among the three groups(P＜0.05). ABPAS staining showed that intervertebral disc in the control and transplantation groups were stained obviously， with a clear structure; while the intervertebral disc in the degeneration group demonstrated a deranged structure with an indistinct pision between the nucleus pulposus and the anulus fibrosus. The content of collagenaseⅡand proteoglycan of transplantation group had significant difference comparing with that of degeneration group(P＜0.05)， but there was no significant difference between the control group(P＞0.05). Conclusion: The rabbit BMSCsPluronic F127 hydrogel complex can repair intervertebral disc degeneration and it provide an experimental foundation for the clinical application of injectable tissue engineered nucleus pulposus complex to treat intervertebral disc degeneration.

　　[Key words] hydrogel； tissue engineering； disc； bone mesenchymal stem cell
　　
　　下腰痛(low back pain，LBP)是骨科最常见的临床症状之一，最新统计［1］显示，LBP对美国的年经济负担已达196到1188亿美元。20%的下腰痛都是因椎间盘退行性疾病(intervertebral disc degeneration disease， IVDD)所引起的。当前临床主要采取椎间盘切除、脊柱融合等非针对退变病因本身的手术治疗，虽然可缓解症状却难以扭转退变［2］，反而会引起继发的脊柱不稳或加速相邻椎间盘的退变(adjacent segment disease， ASD)［3］。近年来，随着着生物治疗概念的提出和发展，通过生长因子、基因干预、细胞移植等手段及时干预退变的诸多环节，为扭转和修复椎间盘退变带来希望［4］。我们设想在对IVDD患者行椎间盘髓核摘除术的同时，将某些具有生物活性的组织移植入椎间盘髓核缺损中，是否会对缺损的椎间盘有修复作用?目前国内外尚少见关于Pluronic F127与骨髓间充质干细胞（BMSCs）复合后植入的体内实验报道。我们以BMSCs为种子细胞，温固化水凝胶Pluronic F127为支架，在低温下将复合物注射入椎间盘髓核缺损退变的动物模型中，检测其修复效果，为进一步的临床应用提供实验依据。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　
　　18只成年新西兰大白兔，体重2～2.5 kg，雌雄不拘，由江苏省农科院动物实验中心提供。LGDMEM培养基(美国Gibco公司)，100%胎牛血清(杭州四季青公司)，胰蛋白酶、木瓜蛋白酶(美国Sigma公司)，Percoll比重1.077g·L-1(美国Pharmacia公司)，Pluronic F127(Sigma公司)，鼠抗人Ⅱ型胶原抗体以及Elivision plus免疫组织化学试剂(迈新公司)，阿尔辛蓝过碘雪夫染料（展晨生物），7.0 T microMRI(德国Bruker公司)，环境扫描电镜(Philips公司)。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 兔BMSCs的分离、纯化、培养

　　取1月龄的新西兰大白兔6只，雌雄不拘，2%的戊巴比妥钠(30 mg·kg-1)耳缘静脉施以全身麻醉，在无菌操作下于双侧胫骨上端内侧部用锐性穿刺锥于骨皮质上开出一直径约2～3 mm的孔，使通达髓腔，各抽取骨髓2 mL。采用密度梯度离心法分离培养BMSCs。倒置显微镜下逐日观察细胞形态并拍照记录。8～12 d细胞长满瓶底90％以上，以0.25％胰蛋白酶消化，按1传2比例分瓶接种传代培养。取第3代细胞进行移植注射。

　　1.2.2 Pluronic F127支架的的构建

　　将Pluronic F127材料15 g融解于50 ml PBS，在冰浴下磁力搅拌过夜，使Pluronic均匀溶解于PBS。高温高压条件下灭菌处理20 min后置于4 ℃冰箱。

　　1.2.3 BMSCs与Pluronic F127复合物的制备

　　取生长良好的GFP阳性BMSCs细胞进行消化，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，将浓缩的细胞团吹散，制成细胞浓度为1×106个ml-1的细胞悬液，转移至离心管中，冰盒内预冷10 min。吸取30%Pluronic凝胶，加入上述含细胞的离心管中，再在冰浴下在振荡器上将细胞和凝胶混合均匀。将预冷的微量注射器针芯拔掉，用1 ml预冷的无菌注射器吸取细胞材料复合物注入微量注射器中，置于4 ℃冰箱备用。

　　1.2.4 实验动物分组及模型的建立

　　18只成年新西兰大白兔随机分为正常对照组、移植治疗组和缺损退变组，每组6只。穿刺制作椎间盘退行性变模型：在全麻下，兔右侧卧位，以横突为轴心，沿左侧第12肋末向下至髂嵴上缘作纵切口，在骶棘肌和腰方肌外缘于胸腰筋膜前层间钝性分离。近腰方肌前内缘触及横突，剪开胸腰筋膜，用小指钝性分离腰大肌即可显露椎间盘。用21号针头分别在L4～5、L5～6进行穿刺，抽吸出的髓核组织，每个椎间盘约抽吸出的髓核组织湿重约2～3 mg，并立即在显微镜下观察以确定只有髓核组织［5］。移植治疗组用预冷的微量注射器将BMSCsPluronic F127复合物25 μl注入缺损的椎间盘中心；缺损退变组注射磷酸缓冲液(PBS)25 μl；正常对照组仅分离暴露椎间盘，不作任何处理。术后在每个相应椎间盘旁的横突上用黑色缝合线做标记，然后冲洗、止血，依次逐层关闭切口，肌肉注射青霉素40万U，连续3 d以预防感染。

　　1.2.5 MIR成像

　　MIR成像水平扫描架内径16 cm，使用61 mm大鼠体部线圈。扫描采用TurboRARE T2WI序列。扫描主要参数：FOV 60 mm×40 mm， TR/TE 4 200 ms/36 ms，层厚1.0 mm，层间距0.5 mm，FA 180°，Matrix 256×256，空间最小分辩率为234 μm×156 μm/像素，总扫描时间约为1 min 20 s。

　　1.2.6 疗效观察

　　(1) 影像学检查。术后8周耳缘静脉注射空气栓塞处死动物，迅速取出脊柱，进行MIR成像。采用Bruker 7.0T microMIR自带的paravision 4.0软件测量3组椎间盘的信号强度和邻近椎旁肌肉的信号强度，计算信噪比(SNR，signalnoise ratio)以评估各组椎间盘退变水平和治疗效果。信噪比计算公式：SNR=SI/noise[6]，SI定义为椎间盘的信号强度，noise定义为椎旁肌肉信号强度的标准差。(2) 病理学检查。MIR扫描完毕，根据定位标记，取出相应椎间盘后置4%中性甲醛固定，石蜡包埋切片，片厚4 μm，行Ⅱ胶原免疫组织化学染色、ABPAS染色。Ⅱ型胶原免疫组织化学染色结果判断:髓核组织间质呈棕黄色为阳性。应用LeicaQ550 IW计算机图像分析系统及其软件(LeicaQwin Pro.2.2)定量评价呈阳性免疫染色的椎间盘细胞间质的灰度值(灰度分级0～255级，0级为最深，255级为最浅)，每只椎间盘取4张切片，每张切片随机采集4个高倍视野(×200)进行测定，向同一个方向移动切片，不重叠，不重复。测得结果为视野内棕黄色的平均灰度值。(3) 蛋白多糖含量测定。取出椎间盘髓核组织，放入5 ml离心管中。加入3%NaOH 1.0 ml，置于恒温振荡器中振荡处理。温度控制在40 ℃，时间3 h。加HCl 4 ml调整溶液的pH值至8～9。加入1%的胰蛋白酶100 μl，置入恒温振荡器中振荡，温度控制在50 ℃，酶解2 h。取酶解液1 ml，采用上述间苯三酚分光光度法测定光密度值，转换为量值作蛋白多糖含量的测定。将吸光度(OD值)按标准曲线折算成浓度，测定出椎间盘中硫酸软骨素含量，结果以mg·（10 ml）-1表示。

　　1.2.7 统计学处理

　　用SPSS 16.0软件进行统计学分析，结果用x-±s表示。采用单因素方差分析F检验，组间两两比较采用Student Newman Keuls(SNK)检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 BMSCs形态学观察
　　
　　BMSCs原代培养24 h后大部分细胞贴壁，细胞较小，呈圆形或卵圆形；3～7 d细胞逐渐变为多角形或梭形，并有大小不一的集落形成；8～10 d集落相互靠近，增殖速度加快；11～13 d细胞集落相互融合，相邻集落融合成片达80%～90%，细胞排列成漩涡状或栏栅状。传代后细胞呈长梭形，均匀的分布(图1)。
　　
　　构建的BMSCsPluronic F127复合物室温下肉眼观察呈凝胶状，环境扫描电镜显示细胞呈圆形或椭圆形，在支架中均匀分布(图2)。

　　2.2 影像学观察
　　
　　8周末MRI检查显示移植治疗组(图3a)与缺损退变组椎间盘(图3b)都有不同程度的退变，与正常对照组(图3c)相比在T2像上信号减弱，椎间隙高度变低。缺损退变组较移植治疗组信号更低，椎间隙也更加狭窄。3组的信噪比(SNR)值(n=12)分别如下：正常对照组为18.152±3.451，移植治疗组为12.615±2.291，缺损退变组为7.525±1.027，经两两比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

　　8周后移植治疗组与正常对照组髓核组织Ⅱ胶原免疫组织化学染色均呈阳性反应，缺损退变组呈阴性反应(图4)。正常对照组Ⅱ胶原免疫组织化学染色切片灰度值测为143.782±2.175，与移植治疗组(142.528±3.326)比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但这两组与缺损退变组(159.782±4.241)比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。

　　2.4 蛋白多糖的测定
　　
　　分光光度法测定8周后各组椎间盘髓核蛋白多糖的含量，结果移植治疗组为(4.628±0.164)mg·(100 mg)-1，与正常对照组[4.737±0.068)mg·(100 mg)-1]比较差异无统计学意义(P＞0.05)，但这两组与缺损退变组［(3.363±0.321) mg·(100 mg)-1］比较差异均有统计学意义(P＜0.05)。
　　
　　2.5 阿尔辛蓝过碘雪夫(ABPAS)染色
　　
　　石蜡切片阿尔辛蓝过碘雪夫染色结果显示：3组切片中的髓核组织均为蓝色，说明8周后髓核中依然存在大量的酸性蛋白黏多糖。正常对照组椎间盘由中央完整的髓核和外周规则同心圆状排列的纤维环组成(图5a)；移植治疗组椎间盘髓核腔相对完整，髓核组织呈类圆形，边界清晰，可见部分髓核与外周纤维环组织融合，部分纤维环组织破碎(图5b)；缺损退变组椎间盘无完整髓核腔，整个中央髓核区域消失，分割为几个不规则髓核区，外周正常纤维环被纤维样组织代替(图5c)。

　　3 讨论
　　
　　本实验所用的细胞载体Pluronic F127是系由聚氧乙烯(PEO)与聚氧丙稀(PPO)组成的一种非离子表面活性共聚物(PEOPPOPEO)，又名泊洛沙姆(poloxamer)。它最大特点是浓度大于100g·L-1的水溶液都有一个凝胶化温度，当温度低于凝胶化温度时，粘度急剧增高，变为凝胶，这种温度依赖性变化的物理性状可重复发生［6］。同时，Pluronic F127具有黏附于接触界面的特性，体内8周左右可完全降解吸收，无明显的免疫排斥反应，降解吸收速度可通过配制溶液的浓度来调节。正是基于Pluronic F127水溶液具有温度敏感原位凝胶的性质，目前已被广泛作为组织工程的细胞支架应用于软骨［7］、皮肤［8］的构建，还作为药物的分散剂［9］和缓释载体［10］用于制药工业，但是用在修复椎间盘退行性变的动物实验中还未见报道。我们通过模拟人体椎间盘镜下髓核摘除的方式将髓核取出，将30%PluronicF127与BMSCs在冰浴下混合均匀后，通过注射植入缺损的椎间盘内，植入后8周组织学观察未见到明显的炎症反应，Pluronic F127水凝胶全部降解。
　　
　　椎间盘内部的髓核组织被内外层纤维环与上下软骨终板紧密包绕，与周围循环毫无接触，其营养主要来自软骨终板的弥散作用。随着年龄的增长，细胞弥散作用减退，细胞过度凋亡增加，生物合成平衡被打破。在生化上表现为Ⅱ型胶原和蛋白多糖的减少、水分的丢失、分解代谢的酶类及炎性介质表达的增加，最终导致了椎间盘的退变［11］。这些变化变现在MRI上，可以表现为椎间隙变的狭窄，椎间盘髓核的T2信号强度减弱。本实验缺损退变组在8周后发生了明显的退行性变，与移植治疗组和正常对照组比较有显著性差异，与文献报道相同［12］。
　　
　　移植治疗组注入复合Pluronic F127后8周，髓核组织Ⅱ胶原免疫组织化学染色结果显示，移植治疗组Ⅱ型胶原含量与缺损退变组比较有明显差异。我们认为其机制是PluronicF127植入体内后利用体温形成不流动的凝胶，避免了椎间盘内压力过大将复合物挤出和因液体渗出而造成种子细胞数量减少，随着PluronicF127在体内的降解，PluronicF127逐渐被BMSCs分泌多种生物活性的细胞基质取代，对残存的退变髓核产生营养的作用，从而增加残存髓核细胞合成细胞外基质的能力。
　　
　　综上所述，本实验采用温控性水凝胶Pluronic F127作为细胞支架，制备BMSCsPluronicF127复合物，通过微创注射移植到退变椎间盘，结果发现可以缓解椎间盘退变，证明温控性水凝胶Pluronic F127可以作为修复椎间盘退变的实验研究材料。与传统的预塑椎间盘组织工程支架材料相比，温控性水凝胶Pluronic F127水凝胶材料其有明显的优越性。通过注射的方法植入缺损的椎间盘内，很容易充满整个具有不规则形状的缺损部位，可减小手术的创伤。故Pluronic F127作为生长因子控制释放载体和药物的缓释细胞支架，通过注射的方法植入退变缺损的椎间盘内是微创治疗椎间盘退变的一个研究新方向。

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