关于银纳米颗粒增强脑胶质瘤细胞放射敏感性的研究

　　　　 作者：马珺，孙新臣，徐睿智，赵迪，童金龙，葛小林

【摘要】 目的：通过制备3组尺寸的银纳米颗粒来研究其增强脑胶质瘤放射治疗的效果。方法:采用柠檬酸钠还原体系制备20、50和100 nm尺寸的银颗粒，通过扫描电镜来表征;检测3种尺寸的银纳米颗粒的细胞毒性以及确定保证细胞活性的安全剂量;通过MTT比色法和集落形成实验检测3组尺寸的银纳米颗粒对脑胶质瘤细胞放射治疗的效果;通过流式细胞术检测银纳米颗粒对细胞周期以及细胞放疗后凋亡率的影响。结果:20 nm的银颗粒能够显著增强脑胶质瘤细胞的放射敏感性，50 nm的银颗粒次之，而100 nm的银颗粒无明显效应。结论:小粒径的银纳米颗粒能够增强脑胶质瘤细胞的放射敏感性，为临床放射治疗提供新的前景。

【关键词】 银纳米颗粒; 放射增敏; 存活分数; 细胞凋亡

　　[Abstract] Objective： To study the effect of three types of silver nanoparticles on enhancing radiosensitivity of glioma cells. Methods: 20， 50 and 100 nm silver nanoparticles were all prepared in sodium citrate system and were characterized by SEM and TEM. The cytotoxicity was tested and the proper dose was determined to guarantee the little effect on cell viability. The effect of silver nanoparticles on radiosensitivity of glioma cells was detected by MTT assay and colonyforming assay. The cell cycles and apoptosis after irradiation were tested by FCM. Results: 20 nm silver nanoparticles significantly sensitized the effect of irradiation treatment upon cancer cells. 50 nm silver nanoparticles had less effect and 100 nm silver nanoparticles had little. Conclusion: Small size of silver nanoparticle can efficiently enhance cytotoxicity of irradiation of glioma， which provide new prospect for clinical radio therapy.

　　[Key words] silver nanoparticles; enhancing radiosensitivity; survival fraction; apoptosis

　　银纳米颗粒在生物医学领域有很多应用价值，它可以作为高性能的抗菌材料[1-4]、光学传感器和生物标记物[5-7]。除此以外，银纳米颗粒还能够抑制病毒的复制，具备抗病毒的功效[8-10]。最近一项研究[11]显示，银纳米颗粒能够进入癌细胞线粒体和胞核中，并可以直接对癌细胞的线粒体产生毒性，损伤癌细胞的DNA。该研究认为银纳米颗粒破坏了癌细胞线粒体的呼吸作用，增加了活性氧的产物，中止了ATP的合成，反过来导致了DNA的受损。DNA的损伤通过银纳米颗粒和DNA相互作用进一步增大，导致了细胞分裂在G2/M期停滞。因此，银纳米颗粒被认为在癌症治疗中具有开发的潜力和价值。作者在上述前人研究的基础上，提出了使用银纳米颗粒作为肿瘤放疗的增敏剂，旨在提高肿瘤细胞放射敏感性，增强X射线对肿瘤细胞的杀伤作用。

　　1 材料和方法

　　1.1 银纳米颗粒的制备

　　3种尺寸的银纳米颗粒均从柠檬酸钠体系、经不同的控制还原方法获得[12-13]。在扫描电镜下对颗粒粒径进行统计分析，确认3种样品尺寸集中分布于20、50和100 nm。获得后银纳米颗粒经离心处理弃掉原溶液中上清，将颗粒溶于少量新生牛血清中，按照血清 ∶DMEM=1∶9的比例加入DMEM培养基，最后样品采用0.2 μm孔径的微孔滤膜进行过滤灭菌。

　　1.2 细胞培养

　　U251细胞购自中国科学院上海细胞研究所，置于含10%新生牛血清的DMEM培养基中，在37 ℃、5%的CO2孵育箱中培养。RNaseA、DMSO、MTT和PI购自Sigma公司。

　　1.3 MTT比色实验分组

　　将U251细胞分为银纳米颗粒结合放疗组和单纯放疗组，分为0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7个剂量照射组。细胞和银纳米颗粒孵育24 h后接受X射线照射，然后接种至96孔板培养，于48 h后终止培养弃去原细胞培养液，每孔加入100 μl新鲜配制的含MTT的无血清培养液，37 ℃继续培养4 h，终止培养。每孔加入二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min。选择570 nm波长，在全自动酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度值(A)，记录结果。

　　1.4 克隆形成实验分组

　　将U251细胞分为银纳米颗粒结合放疗组和单纯放疗组，分为0、0.5、1.0、1.5、2.0、4.0、6.0 Gy 7个剂量照射组。细胞和银纳米颗粒孵育24 h后接受X射线照射，然后稀释至200(0～4 Gy)或2 000(6 Gy)细胞·孔-1接种至6孔板培养14 d后终止培养，固定、染色。

　　1.5 细胞凋亡检测

　　将对数生长期的U251细胞加入AgNPs，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后照射，再过48 h后收集约105细胞。用PBS洗涤细胞2次。加入Binding Buffer悬浮细胞。加入Annexin VEGFP混匀后，加入Propidium Iodioe，混匀。室温、避光、反应15 min。1 h内用流式细胞仪检测荧光强度，并分析数据。

　　1.6 细胞周期检测

　　将对数生长期的U251细胞加入AgNPs，37℃、5% CO2培养箱中培养24 h后照射，再过48 h后收集约105细胞。用PBS洗涤细胞1次后收集。用70%乙醇固定24 h，4 ℃保存。染色前用PBS洗去固定液。加入RNase A 37 ℃水浴30 min。再加入PI(50 μg·ml-1)染色混匀，4 ℃避光30 min。上机检测，记录激发波长488 nm处红色荧光。

　　1.7 统计学处理

　　数据以均数±标准差表示，采用SPSS 13.0软件进行单因素方差分析，组间差异比较采用t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 3个尺寸的银纳米颗粒的细胞毒性

　　由于银纳米颗粒能够在溶液体系中缓释出银离子，体系中银离子的含量取决于银纳米颗粒自身的性质(尺寸和表面包覆等)以及颗粒的浓度。游离的银离子对细胞存在着毒性，银纳米颗粒则存在对细胞剂量依赖的毒性关系。通过MTT检测发现，随着银纳米颗粒尺寸的增加，IC50值在增大。其中，20 nm的银颗粒(图1)在100 μg·ml-1以上显示出明显的细胞毒性(图2)。由于银纳米颗粒对细胞存在剂量依赖的毒性关系，本研究在做放疗增敏实验时均采用IC50值的1/5。在这样低剂量下，银纳米颗粒对细胞活性影响就很微弱。本研究中采用的银纳米颗粒的剂量是20(20 nm)、45(50 nm)和150 μg·ml-1(100 nm)。

　　图1 20 nm的银纳米颗粒SEM图片

　　Fig 1 SEM image of 20 nm silver nanoparticles图2 和20 nm的银纳米颗粒共孵育的U251细胞照片

　　Fig 2 The photo of U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles2.2 MTT和集落实验显示银纳米颗粒降低细胞照射后的存活率 脑胶质瘤细胞和银纳米颗粒共孵育24 h后经射线照射处理，然后去除原培养液中的银纳米颗粒，继续培养48 h。48 h后，通过MTT分别检测各组细胞的活性。结果显示，20 nm和50 nm的银纳米颗粒结合放疗组的细胞活性相对单纯放疗组有明显的下降，而100 nm的银颗粒则无明显变化。其中，20 nm的银纳米颗粒结合X射线对U251细胞活性的影响如图3所示。

　　图3 MTT结果显示和20 nm银纳米颗粒共孵育后，经照射U251细胞生存率相对单纯放疗组明显下降

　　Fig 3 MTT results showed that the survival rate decreased after U251 cells treated with 20 nm silver nanoparticles and irradiation本研究着重对20 nm的银颗粒进行进一步的实验。集落形成实验是对细胞在放疗后增殖能力更精确的验证实验。集落实验显示，和银纳米颗粒共孵育的细胞在照射射线后生存分数(集落数目)相对单纯放疗组有明显下降的趋势(图4)，这意味着肿瘤细胞经银纳米颗粒和X射线共同作用后增殖能力显著降低。图4 集落实验显示，20 nm银纳米颗粒能够显著降低细胞照射后的生存率

　　Fig 4 The colonyforming assay showed that 20nm silver nanoparticles could significantly decrease cell survival rate after irradiation2.3 流式细胞术显示银纳米颗粒能够提高细胞照射后的凋亡率 Annexin VPI检测进一步表明，银纳米颗粒结合放疗组的细胞凋亡率相对单纯放疗组有显著提高(图5)。文献[14]报道银纳米颗粒能够引起更多的细胞停止在G2/M期，本研究的结果和其一致。银纳米颗粒诱导了肿瘤细胞进行周期关卡的自检和修复，而随后经X射线照射作用，更多的细胞进入了凋亡环节。

　　图5 Annexin VPI检测结果显示20 nm银纳米颗粒结合放疗能够显著提高细胞凋亡率

　　Fig 5 The Annexin VPI test showed that 20 nm silver nanoparticles could significantly enhance cell apoptosis rate after irradiation

　　 3 讨 论

　　当前纳米科学与技术正飞速地向前发展，并不断地与各个学科交叉融合，产生出新的研究领域和新的学科生长点，特别是近几年已越来越多地渗透到医学领域，形成了一个快速发展的新学科。因此，纳米科学的发展为放射增敏剂的研究提供了新的平台。纳米材料与放射增敏关系的研究国内外已有一些文献报道。如使用PLGA纳米材料包裹SR2508(依他硝唑)、多西紫杉醇等对MCF7和HeLa细胞进行放射增敏[15-16]。金纳米材料在老鼠结肠癌细胞株和乳腺癌细胞株上均发现增敏现象[14，17]。

　　本研究在前人研究的基础上提出使用银纳米颗粒增强肿瘤放疗的作用。银纳米颗粒在体外对细胞的毒性相对同等剂量的银离子要小很多，在低浓度下对细胞活性的影响微弱。银纳米颗粒对细胞的毒性存在剂量依赖的关系，并且和自身尺寸相关。选取低剂量的银纳米颗粒和肿瘤细胞共孵育，银纳米颗粒能够进入肿瘤细胞内缓释出银离子，从而干扰细胞DNA的复制与修复[11]。受干扰的肿瘤细胞经X射线照射后，更多的细胞不再停留于自检和修复阶段，而直接进入凋亡。

　　本研究通过实验验证，20 nm的银纳米颗粒能够显著降低肿瘤细胞放疗后的存活分数，50 nm的银颗粒次之，而100 nm的银颗粒则无明显现象。作者认为这可能是20 nm的银颗粒更容易被细胞吞噬，并且相对其它两种颗粒在细胞内能够缓释出更多的银离子。

　　集落形成实验是衡量细胞在接受射线照射后增殖能力的一个金标准。本研究通过集落实验验证U251细胞经过和20 nm银颗粒共孵育后，经X射线照射后的存活率相对单纯放疗组呈明显下降趋势。通过流式细胞术的检测显示，和20 nm银颗粒共孵育的细胞照射射线后凋亡率得到进一步提高。

　　通过对本研究结果的分析可以推测，在不远的将来，可以进一步开发出以银纳米颗粒为核心的药物，从而达到增强放疗效果的目的。

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