SD大鼠肾小管上皮细胞的原代培养和鉴定

　　　　 作者：何锦园，曾国华，吴文起，钟文，桂志明，麦赞林

【摘要】 目的：探讨大鼠肾小管上皮细胞的体外培养及鉴定方法，为肾结石病的研究提供实验平台。方法：采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离出肾小管节段，在含10%胎牛血清和1%上皮细胞生长因子的上皮细胞培养基中培养，0.25%胰蛋白酶消化后传代培养，并用原代和传1代细胞做免疫细胞化学染色鉴定。结果：细胞培养至第3天完全贴壁，4～7 d处于对数生长期，为多边鹅卵石样;免疫细胞化学染色显示cytokeratin 18表达阳性。结论:机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法结合使用上皮细胞培养基可以培养得到较纯的肾小管，是大鼠肾小管上皮细胞原代培养的理想方法，为进一步研究泌尿系结石病因和机制提供了实验基础。

【关键词】 肾小管上皮细胞; 原代培养; CK18; 大鼠

　　[Abstract] Objective： To discuss the method of the primary culture and identification of SD rats renal tubular epithelial cells， thus to supply an experimental platform for the study of renal calculi.Methods： The renal tubular segments were isolated by mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion. The collected cells were cultured with EpiCM，which contained 10% FBS and 1% EpicGs， in incubation with 5% CO2 at 37 ℃， and subcultured with 0.25% trypsin.The cultured cells were identified by immunocytochemistry. Results: The cultured cells were completely adhered after 3 days， the logarithmic growth phase was beween 4 and 7 days. The cells were large， displaying the typical cobblestone appearance.Immunocytochemistry suggested that the expressions of cytokeratin 18 in renal tubular epithelial cells were positive. Conclusion: Mechanical grinding and collagenase Ⅰdigestion combined with EpiCM is an ideal method to collect and culture the renal tubular epithelial cells，and it provides the experimental basis for further study of the etiology and mechanism of urinary tract stones.

　　[Key words] renal tubular epithelial cells; primary culture; CK18; rats

　　尿石症是泌尿外科最常见的疾病之一，主要病因包括遗传、环境、饮食、代谢等。一般认为，它的形成是一系列化学的、生化的、生理的及分子调节等因素综合作用的结果[1]，其早期病变是微小晶体黏附在肾小管上皮细胞表面并引起损伤。可见，肾小管上皮细胞可以作为进一步研究尿石症病因及发病机制的一个实验平台。目前，国外已建立部分种属的肾小管上皮细胞株，但价格昂贵且不易获得。本实验旨在探讨一种理想的肾小管上皮细胞原代培养方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　实验动物：SD大鼠2只，一雄一雌，体重分别为220 g和200 g，由广州中医药大学动物实验中心提供[许可证号为SCXK(粤)20080020粤监证字2008A002]。主要试剂：胎牛血清(Gibco公司)、上皮细胞培养基EpiCM(美国ScienCell公司)、Ⅰ型胶原酶(Sigma公司)、胰蛋白酶(Gibco公司)、青/链霉素(Sigma公司)、cytokeratin 18一抗(美国Santa Cruz公司)、山羊抗小鼠二抗(北京博奥森公司)、上皮细胞生长因子EpicGs(美国ScienCell公司)、PV9005小鼠超敏二步法免疫组化试剂盒(北京中杉金桥)、ZLI9017浓缩型DAB试剂盒(北京中杉金桥)。主要仪器：80和100目不锈钢筛网(广州普博生物公司)、XDS1B型倒置相差显微镜(日本Olympus公司)、荧光倒置显微镜(日本Olympus公司)、CO2细胞培养箱(Thermo公司)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 肾小管节段的分离提取 大鼠实验前禁食12 h，水摄入不限。颈椎脱臼后于70%酒精中浸泡2～3 min后取出，在超净台上无菌取下两侧肾脏。在盛有PBS培养皿中去除肾蒂和包膜，剪碎肾皮质至约1 mm3大小(冰上操作)，PBS反复冲洗3遍去除血质后转移到80目筛网上，研磨并以PBS充分冲洗，网下液体倒至100目筛网上，收集网上物于培养皿中，反复吹打转至15 ml离心管，1 200转·min-1离心10 min。

　　1.2.2 肾小管节段的消化和肾小管上皮细胞的原代培养 离心后弃上清，加入1 mg·ml-1的Ⅰ型胶原酶2 ml，0.1 mg·ml-1的DNase 0.1 ml，充分混匀，37 ℃水浴震荡消化约30 min，加入不含血清的EpiCM 2 ml终止消化，混匀，1 600转·min-1离心6 min，弃去上清，加入4 ml含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，吸管充分轻轻混匀后移入25 cm2培养瓶中，在5% CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。

　　1.2.3 肾小管上皮细胞的传代培养 原代培养至第3天首次换液，以后每两天换1次，至第6天细胞基本铺满整个瓶底，吸去瓶内全部培养液，用PBS洗涤3次，分两组进行消化，各滴加0.25%胰蛋白酶(A组)、0.25%胰蛋白酶-0.02%EDTA复合液(B组)1.5～2.0 ml(以刚好能全部覆盖瓶底细胞为标准)，37 ℃消化1～2 min，镜下见约85%细胞收缩、变圆，少许脱落，此时立即加入双倍的含10%胎牛血清、1%上皮细胞生长因子、1%双抗的上皮细胞培养基EpiCM，用吸管顺瓶底轻轻吹打使细胞完全脱落、充分混匀，细胞计数后以1∶2的比例传代培养。

　　1.2.4 肾小管上皮细胞的鉴定 形态学：倒置显微镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强，各细胞紧密相连。免疫细胞化学：将传1代的肾小管上皮细胞接种于装有盖玻片(经泡酸、灭菌处理)的24孔细胞培养板中，待细胞约长满时取出盖玻片。PBS冲洗2次，4%冷多聚甲醛固定30 min，PBS冲洗2次后加3% h3O2去离子水孵育10 min阻断内源性过氧化物酶，cytokeratin 18一抗(1∶400)4 ℃过夜(阴性对照用PBS替代一抗)，二抗(即用型)37 ℃孵育1.5 h，再DAB显色、自来水冲洗、苏木素复染、脱水、透明、封片。普通光学显微镜下观察结果。

　　2 结 果

　　刚提取的肾小管节段如图1所示。原代培养的肾小管上皮细胞12 h左右即有贴壁，24～36 h后可见上皮样细胞从贴壁的节段外周爬出，使得此时整个培养瓶底的细胞呈“岛屿状”(图2)，培养第3天后首次换液。第4～7天是对数生长期，约6～7 d基本长满瓶底(图3)。镜下观察细胞体积较大，呈多边鹅卵石样，透明度和折光性较强。传代细胞A组第2天贴壁，第5～6天呈指数性生长，形态多为短梭形，少数呈多边形鹅卵石样;B组3 d后少量细胞贴壁，形态不一，细胞连接不紧密，折光性较差，至第7天左右细胞全部漂浮、死亡。免疫细胞化学染色检测肾小管上皮细胞特异性表达的cytokeratin 18，在镜下可见肾小管上皮细胞的胞核周围及胞质内有不均匀分布的棕褐色颗粒(图4、5)，而阴性对照组未见到(图6)，证明培养的是肾小管上皮细胞。

　　3 讨 论

　　尽管关于泌尿系结石的形成机制在国内外已有不少研究，但仍存在一些未曾阐明的问题。目前已有多种学说，如肾钙斑学说、过饱和结晶学说、基质学说等[2]。总而言之，肾结石的形成是一个多因素参与的过程，包括尿液的过饱和、微小晶体的形成及结晶的生长和成熟等。其中，微小晶体黏附于肾小管上皮细胞表面并引起损害被认为是肾结石形成过程中关键的一个环节[3-4]。由此可见，利用体外培养的肾小管细胞作为一个实验平台，可以更进一步研究阐述泌尿系结石的形成机制。

　　目前，国内外已建立了猪、兔、大鼠和人等多种不同种属的肾小管上皮细胞株，虽然可以在短时间内获得数量足够的细胞，但价格昂贵且不易获得。况且，在反复传代过程中细胞株会丧失某些功能甚至发生转分化等[5]，不能完全代表其正常的生理状况，且可能还具一些致瘤性[6]，因此不适合研究的需要。肾小管上皮细胞的培养方法除应用细胞株培养外，还有另外两种方法。其一是先分离筛选出肾小管节段，然后进行培养;其二是van Kooten等报道的通过选择性培养基促进上皮细胞的生长，同时抑制其他细胞的生长[7]。虽然原代培养技术要求高、传代次数有限，但它更接近生理状况，细胞的变化相对稳定，既没有损伤也没有严格的研究时间限制[8]。目前，国内外有报道用Percoll密度梯度离心法分离肾小管细胞，Percoll为一种包有乙烯吡咯烷酮的硅胶颗粒，它具有不穿透生物膜，对细胞无毒害的作用，其密度为1.130 g·ml-1，可根据活细胞、接近死亡的细胞以及细胞碎片密度不同而将其分离开，以获得活性较好的细胞[5，9-10]。但是，用此法大大增加了细胞提取的操作时间，也会影响细胞的活性，另外Percoll密度梯度离心法所获得的肾小管节段数量少。Mattila等报道，采用研磨、筛网过滤的方法能达到分离肾小管节段和肾小球的目的[11]。本研究应用80目和100目孔径的不锈钢筛网分离肾小管，可以排除肾小球上皮细胞的混杂，肾小管细胞的纯度可达到90%以上，且与Percoll密度梯度离心法相比，研磨消化法获得的细胞数量较多。对于肾小管上皮细胞的消化，国内报道多采用胰蛋白酶，但是浓度难以确定，过高(&>0.25%)会影响细胞贴壁和生长，甚至无法传代;过低又不能很好地消化细胞[12-13]。用1 g·L-1的Ⅰ型胶原酶消化20～30 min效果佳，培养的细胞贴壁率高，长势良好。在原代培养中，本实验应用上皮细胞培养基和上皮细胞生长因子，可以使成纤维细胞和其他一些杂细胞的增殖大部分甚至完全被抑制，从而有利于上皮细胞的生长，得到的细胞纯度高[7，14]。在原代细胞生长至第6天传代培养时，用0.25%胰蛋白酶消化，传代后的细胞贴壁和生长情况良好;而用0.25%胰蛋白酶0.02%EDTA复合液消化，肾小管细胞贴壁需要时间长且数量少，无法继续生长，原因可能是肾小管上皮细胞对EDTA敏感，EDTA对其有抑制性。

　　上皮细胞中间纤维结构中含有角蛋白成分，是上皮细胞的特异性标志。肾小管上皮细胞主要表达cytokeratin 18[15]，尽管有报道肾小球足细胞、球囊上皮细胞也有角蛋白表达(未明确是否为18型)，但使用研磨、分离方法已将肾小管和肾小球细胞分离纯化，故不会对实验造成影响。本实验采用原代和传一代的细胞进行免疫细胞化学染色，选择cytokeratin18一抗(浓度为1∶400)进行特异性鉴定。镜下均发现细胞质和细胞核周围有棕褐色不均匀散在分布、强度不一的阳性颗粒，再结合上皮细胞的镜下特点(典型的多边鹅卵石状，细胞间相连紧密)，证实培养的细胞是肾小管上皮细胞。

　　肾小管上皮细胞的原代培养较难，各方面要求较高，通过多次培养，在实验过程中我们体会到以下几点的重要性：(1) 肾小管节段的获取必须严格无菌。(2) 肾小管细胞的消化尽量选用Ⅰ型胶原酶，效果佳。对于使用胰蛋白酶，没有明确的推荐浓度。国内王东等提出胰蛋白酶的浓度为0.2%～0.25%时对肾小管细胞消化较好[12]。而廖晓星等报道0.2%以上的浓度将明显影响肾小管细胞的贴壁和生长，并建议以0.15%为宜[13]。(3) 在分离培养后的前3 d内，由于组织块粘贴不牢，尽量不要移动培养瓶。(4) 72 h后首次换液，若细胞贴壁不理想可以半换液，但在操作中注意动作轻巧，避免因液体震荡对细胞的冲击引起其漂浮。以后依据细胞生长情况及时换液，一般每两天1次，否则漂浮物会对细胞有毒性作用。(5) 使用一次性塑料培养瓶的肾小管细胞贴壁所需时间比用玻璃培养瓶短，且生长更好。

　　本实验证明，采用机械研磨、Ⅰ型胶原酶消化法分离肾小管节段，结合使用含EpicGs的上皮细胞培养基原代培养肾小管上皮细胞是一种理想的方法，为进一步研究泌尿系结石的病因及机制奠定了实验基础。

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