催产素预处理对胎鼠海马脑片缺氧无糖损伤后OTR、GABAARβ1表达的影响

【摘要】 目的：研究催产素(OT)预处理对胎鼠海马脑片缺氧无糖损伤后催产素受体(OTR)、γ氨基丁酸A受体β1亚基(GABAARβ1)表达的影响，探讨OT神经保护的作用机制。方法： 采用胎龄20 d SD大鼠海马脑片，实验组经含10-6mol·L-1 OT人工脑脊液(ACSF)孵育预处理后行缺氧无糖损伤(OGD)，对照组经正常ACSF孵育后直接行OGD，各15 min，SP免疫组化法半定量测定海马CA1区OTR、GABAARβ1表达变化，电镜观察神经元损伤情况。结果： 实验组海马CA1区OTR、GABAARβ1表达均显著高于对照组(t=2.118、P=0.048;t=2.272、P=0.036)。对照组大量神经元受损，核固缩或碎裂，部分核膜溶解，实验组细胞核、粗面内质网、线粒体均较对照组有所改善，核膜较光滑，胞浆肿胀较对照组减轻。结论： OT上调胎鼠海马OTR、GABAARβ1表达，减少神经元变性坏死，增强大脑耐受缺氧损伤的能力，对胎儿中枢神经系统起保护作用。

【关键词】 催产素; 海马; 缺氧无糖损伤; 催产素受体; γ氨基丁酸A受体β1亚基

　　[Abstract] Objective： To study the effects of oxytocin(OT) on changes of oxytocin receptor(OTR)， gammaamimobutyric acid receptor A β1 subunit(GABAAR β1) expressions in fetus rat hippocampus induced by oxygen and glucose deprivation(OGD)， and to investigate the mechanism of neuroprotective effects of OT. Methods： Gestational age 20 days SD rat hippocampus slices in the experimental group underwent pretreatment incubation by containing 10-6 mol·L-1 OT artificial cerebrospinal fluid(ACSF)， the control group were incubated with normal ACSF. Oxygen and glucose deprivation(OGD) was done for 15 min， respectively. SP immunohistochemistry and semiquantitative technique were taken to determine hippocampus CA1 area OTR， GABAAR β1 expressions， and observe neuronal damage in electron microscopy. Results: The expressions of OTR， GABAAR β1 in CA1 area of hippocampus were significantly higher in the experimental qroup(t=2.118， P=0.048; t=2.272， P=0.036). A large number of damaged neurons ， nuclear condensation or fragmentation， some of the nuclear membrane dissolved in the control group; while nuclei， rough endoplasmic reticulum， mitochondria were improved， nuclear membrane was smooth， cytoplasmic swelling were eased in the experimental group. Conclusion: OT can increase hippocampal OTR， GABAAR β1 expressions， decrease neuronal degeneration and necrosis， enhance the capacity of the brain tolerance to hypoxia， and play the protective effects on fetal nervous system.

　　[Key words] oxytocin; hippocampus; oxygen and glucose deprivation; oxytocin receptor; gammaamimobutyric acid receptor A β1 subunit

　　新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxicischemic encephalopathy， HIE)是围产期缺氧、窒息导致脑的缺氧缺血性损害，临床出现一系列中枢神经系统异常表现的疾病，是引起新生儿死亡的主要原因之一，也是引起婴幼儿神经系统后遗症状的重要原因。各家报道HIE的死亡率和致残率仍为10%～30%。范晓梅[1]在对12 000名活产儿进行调查中发现，HIE的发病率为1%，其中以胎儿窘迫为主要病因，占HIE发病的91.7%。大脑被剥夺氧和葡萄糖后可引起神经元损伤和死亡，当神经和神经胶质细胞处在发育时期，这种损伤就更为严重[2]。催产素(oxytocin， OT)是一种古老的内分泌激素，早期对OT的研究多侧重于其在分娩发动、乳汁分泌等方面的作用，近年来学者逐渐重视OT与神经精神系统发育的相关性研究。本实验室曾报道OT对孕晚期胎鼠海马缺氧无糖损伤(oxygen and glucose deprivation，OGD)有神经保护作用，其机制可能与γ氨基丁酸(GABA)有关[3]。现进一步围绕OT对OGD胎鼠海马催产素受体(oxytocin receptor， OTR)、γ氨基丁酸A受体β1亚基(gammaamimobutyric acid receptor A β1 subunit，GABAAR β1)表达的影响，探讨OT在胎儿神经保护方面的作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 动物及材料

　　1.1.1 实验动物 孕龄20 d SD大鼠4只，体重500～800 g，由南京市江宁区青龙山动物繁殖场提供。

　　1.1.2 试剂及器材 人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid， ACSF)成分(mmol·L-1)[4]：葡萄糖10.0、NaCl 120.0、KCl 3.33、Nah3 PO4 1.25、MgSO4 2.4、NaHCO3 26.0、CaCl2 2.5;通入95%O2+5%CO2混合气体至少30 min 达到饱和，流量约为200 ml·min-1，HCl调至pH 7.35～7.45。缺氧无糖人工脑脊液(artificial cerebrospinal fluid/oxygen and glucose deprivation， ACSF/OGD)：将混合气体95%O2+5%CO2换为95%N2+5%CO2，并且将ACSF中的葡萄糖换为同浓度的蔗糖。OT(上海第一生化药业)，OTR兔抗大鼠多克隆抗体(武汉博士德)，GABAAR β1兔抗大鼠多克隆抗体(Bioworld公司);SP免疫组化试剂盒(北京四正柏生物公司);数显恒流泵(上海沪西分析仪器厂);混合气体95%O2+5%CO2、95%N2+5%CO2(南京特种气体)。

　　1.2 方法

　　1.2.1 离体海马脑片制备 孕鼠乙醚吸入麻醉，2%碘酒及75%乙醇消毒腹部剖腹取出胚胎，剥除胎盘完全暴露胎鼠，断头取脑后置于0～4 ℃ACSF中降温1 min。用刀片冠状面切割全脑制作1～2 mm脑片，保留包含海马的脑片，共得包括海马区脑片40片。将脑片转移至温度为(32.0±0.5)℃的ACSF中，不断通入95%O2+5%CO2混合气体，流量为200 ml·min-1，孵育2～3 h备用。

　　1.2.2 实验分组和给药方法 实验用海马脑片共40片，对照组和实验组各20片。对照组用正常ACSF孵育2 h，待其充分作用后通入ACSF/OGD，行OGD 15 min。实验组则将正常ACSF换成含10-6 mmol·L-1 OT的ACSF孵育，余同对照组。

　　1.2.3 评价

　　1.2.3.1 苏木素伊红染色 海马脑片经4%甲醛固定后，24 h内常规石蜡包埋切片，苏木素伊红染色制片。切片光学显微镜40×10倍视野下观察海马组织CA1区神经元排列、细胞形态变化及细胞核情况。

　　1.2.3.2 SP免疫组化法半定量检测海马脑片CA1区OTR、GABAAR β1表达 具体操作按照试剂盒说明书。SP法即链霉素抗生素蛋白过氧化物酶连接法。石蜡切片依次经过二甲苯脱蜡、抗原修复后，行一抗+生物素标记二抗+辣根酶标记链酶卵白素+辣根酶底物DAB显色。免疫组化染色阳性反应为细胞膜呈黄棕色。每张切片光镜20×10倍下定位海马CA1区，然后40×10倍下用ImagePro Plus 6.0图像分析软件测量CA1区阳性细胞的平均光密度值，分析OTR、GABAAR β1的表达。

　　1.2.3.3 透射电镜观察 每组胎鼠各取2只，断头后立即取大鼠左侧海马组织2 mm×2 mm×5 mm，固定于3%戊二醛，1%锇酸双固定，Epon812树脂包埋，超薄切片机切片，醋酸双氧铀柠檬酸铅双重染色，透射电子显微镜观察。电镜下观察神经元、胶质细胞等超微结构改变。

　　1.3 统计学处理

　　用SPSS 11.5统计软件包进行统计学分析。实验数据以均数±标准差表示，采用组间t检验及方差分析作统计学显著性检验。

　　2 结 果

　　2.1 苏木素伊红染色结果比较

　　光学显微镜下，细胞核呈深蓝色，胞浆呈淡红色。实验组脑片中可见海马CA1区锥体细胞呈多层排列，结构清晰，细胞排列较整齐紧密、分布亦较均匀，神经细胞数目多、外形规则，细胞层可分3～5层，胞核圆形或椭圆形，染色较淡，染色质均匀，偶见核深染或固缩，核膜边界清晰，核仁圆且明显。对照组脑片中可见海马CA1区神经细胞层次变少，数量减少，排列紊乱、稀疏。部分神经细胞核深染、固缩，核仁不明显，细胞周围间隙增大。见图1、2。

　　2.2 免疫组织化学染色结果比较

　　2.2.1 OT对胎鼠海马脑片CA1区OTR表达的影响 实验组与对照组胎鼠海马脑片CA1区OTR免疫组织化学染色均有阳性反应，分别行平均光密度值测定，实验组OTR表达的平均光密度值为(0.172±0.017)，与对照组(0.152±0.024)比较显著升高(P=0.048&<0.05)，差异有统计学意义，见表1。表1 海马脑片CA1区OTR表达平均光密度值比较

　　2.2.2 OT对胎鼠海马脑片CA1区GABAAR β1表达的影响 实验组与对照组胎鼠海马脑片CA1区GABAAR β1免疫组织化学染色均有阳性反应，分别行平均光密度值测定，实验组GABAARβ1表达的平均光密度值为(0.142 ±0.018)，与对照组(0.124 ±0.020)比较显著升高(P=0.036&<0.05)，差异有统计学意义，见表2。表2 海马脑片CA1区GABAAR β1表达平均光密度值比较

　　2.3 电镜观察海马神经细胞的损伤情况

　　对照组大量神经元受损、变性、坏死，核固缩或碎裂，部分核膜溶解，染色质呈团块状凝集，核仁碎裂，胞质内细胞器明显减少导致电子密度变低。其中细胞核超微结构改变见图3。

　　实验组细胞核、粗面内质网、线粒体均较对照组有所改善，核膜较光滑，染色质细小而分散，胞浆肿胀较对照组减轻，可见较多的细胞器。亦可见核膜皱褶内陷，核固缩，染色质凝集、边集等凋亡现象。其中细胞核超微结构改变见图4。

　　3 讨 论

　　胚胎中晚期及出生早期是海马神经元发育成熟的关键时期，海马结构中锥体细胞的产生、迁移、定位等均于胚胎时期完成。由于中枢神经系统对氧具有高敏感性，发育中的神经元对氧的需求较高。分娩过程对胎脑来说是具有高损伤风险的应激性事件，而这种应激主要来自产前、产时宫缩形成的相对缺氧状态。因此，离体状态下研究OT对孕晚期胎鼠海马OGD是否有神经保护作用及作用机制具有重要意义。

　　3.1 OT及OTR系统

　　OT为9个氨基酸组成的多肽，在哺乳、分娩、应激等刺激下释放入血液循环。OTR是经典G蛋白偶联受体，当OT与OTR胞外区结合后，活化胞内区Gq亚单位后激活磷脂酶Cβ进而产生一系列的生理功能[5]。本实验中经OT预处理的胎鼠海马脑片经OGD后，CA1区OTR较对照组显著升高，上调了OTR在细胞膜上的表达。

　　3.2 GABA及GABAR系统

　　在成熟的大脑中GABA是重要的抑制性神经递质，GABA通过与其受体(gammaaminobutyric acid receptor， GABAR)结合而发挥作用。GABAAR在神经系统广泛分布，主要介导突触后抑制效应，其中β1亚基是受体主要激活位点。在未成熟神经元，GABA是主要的兴奋性神经递质，对胎儿期和新生儿期神经元发育至关重要。当GABA与GABAAR结合，配体门控氯离子通道开放，神经元胞膜对Cl-通透性增加，Cl-流出神经元，神经元产生去极化效应，激活电压依赖性Ca2+通道，从而使细胞内Ca2+浓度升高，对神经元的生长和分化发挥重要作用[6]。研究发现分娩时主要来源于母体下丘脑的OT通过胎盘屏障和胎儿血脑屏障到达胎儿大脑[7]，通过降低氯离子内向协同转运体(Na+K+2Cl-cotransporter 1，NKCC1)的活性以减少Cl-的内源性转运，使得神经元内Cl-浓度下降[8]。本实验中经OT预处理的胎鼠海马脑片经OGD后，CA1区GABAAR β1较对照组显著升高，上调了GABAARβ1在细胞膜上的表达。当GABA作用于GABAAR时，配体门控Cl-通道开放增加，Cl-顺浓度差内流增加，GABA效应由兴奋性向抑制性转化。

　　3.3 OT与OTR、GABAAR β1关系

　　缺血缺氧可直接导致海马细胞损伤、能量衰竭。脑血流和氧运输的减少启动潜在有害生化级联反应，包括葡萄糖氧化磷酸化中断，细胞内ATP迅速耗竭，乳酸堆积、细胞膜去极化、兴奋性氨基酸释放以及细胞内Na+、Ca2+、水、自由基堆积，从而导致细胞毒性水肿和细胞死亡。本实验海马脑片石蜡切片HE染色、电镜结果均提示，实验组细胞的变性坏死明显减少，OT对海马神经元起保护作用。

　　本实验研究结果显示，经OT预处理的胎鼠海马脑片OGD后与对照组比较，OT显著上调OTR、GABAAR β1表达。OT可能通过一系列的下游机制抑制NKCC1活性，降低神经元内Cl-浓度，Cl-顺浓度差内流增加，当GABA与GABAAR结合时，配体门控Cl-通道开放增加，GABA效应由兴奋性向抑制性转化，导致神经元去极化抑制，减少神经元的耗氧量，从而增强大脑耐受缺氧损伤的能力，减轻分娩中缺氧和低血糖等伤害事件对胎儿大脑的损伤，实现对胎儿神经系统的保护作用。

参考文献

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　　[4] PUGLIESE A M， COPPI E， VOLPINI R， et al. Role of adenosine A3 receptor on CA1 hippocampal neurotransmission during oxygenglucose deprivation of different duration[J].Biochem Phamacol，2007，74(5):768779.

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