顺铂对肺癌细胞耐药基因表达水平的影响

【摘要】 研究顺铂（DDP）对肺癌细胞耐药基因MRP1，MGMT，XPA和XPB表达水平的影响，探讨不同耐药机制在肺癌耐药过程中的作用。方法： 以噻唑蓝还原法（MTT）检测DDP对肺癌细胞A549生存率的影响，实时荧光定量PCR技术检测DDP处理前后肺癌细胞MRP1，MGMT，XPA和XPB mRNA的表达水平。结果： 不同浓度DDP（1.25～40 μg/ml）处理肺癌细胞48 h，细胞的生存率从74.7%降至17.4%。4 μg/ml DDP处理肺癌细胞12， 24和48 h后，细胞生存率分别为96.1%，73%和48.5%。DDP处理引起细胞的MRP1 mRNA表达水平先下降后上升；MGMT mRNA表达水平下降；XPB和XPA mRNA表达水平均增高。结论： DDP可以导致肺癌细胞耐药基因MRP1，MGMT，XPA和XPB mRNA表达水平的改变，提示多种耐药机制参与了DDP引起的肺癌细胞耐药。

【关键词】 肺癌 顺铂 耐药 MRP1 MGMT XPA XPB

　　［Abstract］ Objective: To study the effect of cisplatin (DDP)on expression levels of drug resistance associated genes MRP1，MGMT，XPA，XPB in lung cancer cells， and explore the effect of different mechanisms in drug resistance of lung cancer cell.Methods： Cell survival rate was measured using MTT metabolic viability assay.The levels of genes expression was measured by real time fluorescent quantitative PCR assay. Results： The cell survival rate decreased from 74.7% to 17.4% after 48 h treatment of DDP ranging concentration of 1.25～40 μg/ml.The cell survival rate decreased to 96.1%，73%，48.5% respectively after 12， 24， 48 h treatment with 4 μg/ml of DDP.The level of MRP1 mRNA expression increased after the first drop; MGMT mRNA expression levels drop; XPB and XPA mRNA expression levels both increased in these cells treated with DDP. Conclusion： DDP could lead to the expression levels change of MRP1， MGMT， XPA， XPB mRNA in lung cancer cell.The results indicated that varieties drug resistant mechanisms are associated with drug resistant mechanisms developing of lung cancer.

　　［Key words］ lung cancer; cisplatin; drug resistance; MRP1； MGMT； XPA； XPB

　　近年来，虽然肺癌化疗效果随着新药的问世有了一定程度改善，但总的效率仍不理想。这与药物的抗癌作用选择性差，肿瘤的多药耐药（multidrug resistance， MDR）以及患者的个体差异有关。其中，MDR是导致化疗失败的重要原因。肿瘤细胞的耐药性涉及细胞的多种生化改变，包括膜蛋白介导的耐药机制、酶修复机制、核苷酸切除修复（nucleotide excision repair， NER）机制等，研究肺癌细胞的耐药机制对于寻找新的治疗对策有着至关重要的作用［1］。本研究采用实时荧光定量PCR技术检测肺癌细胞经顺铂（cisplatin，DDP）处理后上述三种耐药机制中相关基因的表达水平，探讨不同耐药机制在肺癌发生过程中的作用。这些基因分别是：参与膜蛋白介导耐药机制的多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein 1，MRP1）基因，酶修复机制中的O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶（O6methylguanine methytransferase， MGMT）基因，NER机制中的着色性干皮病A (xerodema pigmentosum group A， XPA)和着色性干皮病B(xerodema pigmentosum group B，XPB)基因。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂与仪器

　　DMEM培养基（Gibco公司），新生牛血清（甘肃兰州民海生物工程有限公司），DDP（山东德州德药有限公司），噻唑蓝（Amresco公司），二甲亚砜（Amresco公司），Trizol试剂盒（Invitrogen公司），ReverAid试剂盒（Mbi公司），实时PCR 试剂盒（Toyobo公司）。倒置式生物显微镜（TE300，Nikon），酶标仪(BioTek公司)。荧光定量PCR分析仪（Stratagene Mx3000P）。肺癌细胞A549由江苏大学生命科学院提供。

　　1.2 细胞处理

　　取处于对数生长期的A549细胞，胰酶消化后充分吹打成单细胞悬液，计数。用培养基调整其浓度至1×105/ml，每次取100 μl 接种至96孔板，贴壁过夜。DDP用DMEM培养液配置。剂量效应：设6个剂量组（DDP终浓度分别为1.25， 2.5， 5， 10，20，40 μg/ml）和对照组，DDP处理48 h，MTT法检测细胞生存率。时间效应：设4个点，为细胞处理前和经4 μg/ml DDP处理后12，24，48 h， MTT法检测细胞生存率。并采用实时荧光定量PCR测定MRP1，MGMT，XPA和XPB mRNA表达水平。

　　1.3 MTT法检测DDP对细胞生存率的影响

　　细胞经相应处理后，每孔加入5 mg/ml MTT 20 μl，培养4 h。吸尽培养液，加入二甲亚砜150 μl/孔，震荡10 min，酶标仪测定570 nm处D值。每组设10个复孔，计算平均值。细胞的生存率=（实验组细胞D值/对照组细胞D值）×100% 。

　　1.4 荧光实时定量PCR

　　细胞处理结束后，用Trizol试剂提取细胞总RNA，经紫外分光光度仪检测总RNA的浓度后，用ReverAid试剂盒反转录获得cDNA，最后选用实时PCR 试剂盒在荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。引物应用Primer 5.0软件设计，引物序列：βactin：上游引物5′ACACTGTGCCCATCTACGAGG3′，下游引物5′AGGGGCCGGACTCGTCATACT3′，产物长度250 bp； MRP1：上游引物5′GCAGAACTTTCAGCCAGTGAACAA3′，下游引物5′ACAATACCAGCCGGGTCAAGAG3′，产物长度256 bp；MGMT：上游引物5′TCGCTCCATGAATGGCAAGATA3′，下游引物5′TTCCATGGGAGCCTGGATGTA3′，产物长度211 bp；XPA：上游引物5′GCTACTGGAGGCATGGCTAAT3′，下游引物5′GTTGGCAAATCAAAGTGGTTC3′，产物长度212 bp；XPB：上游引物5′GCTACATCGCCAAAGTCCAG3′，下游引物5′CGTAGATATAGGGTTTGTTCAGTCA3′，产物长度246 bp。引物由上海英骏生物技术公司合成。

　　反转录体系总体积为20 μl，包括总RNA 1 μg，Oligo(dT)18 1 μl，5×反应缓冲液4 μl，10 mmol/L dNTP 2 μl，RNA酶抑制剂 1 μl，MMuLV反转录酶 1 μl（按说明书操作）。PCR体系总体积为20 μl，包含cDNA 1 μl，Master Mix 10 μl，1 μmol上下游引物各1 μl，双蒸水补足体系。扩增条件：95℃ 5 min预变性，95℃变性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，40个循环后制作熔解曲线。以βactin作为内参照，定量分析MRP1，MGMT，XPA和XPB mRNA的相对表达水平。

　　1.5 统计学处理

　　DDP处理肺癌细胞后生存率变化分析采用秩相关分析，DDP处理肺癌细胞前后4种基因mRNA表达水平变化的比较采用秩和检验中的F检验，用SPSS13.0统计软件包进行数据相关分析。

　　2 结 果

　　2.1 肺癌细胞生存率的变化

　　用不同浓度DDP处理肺癌细胞A549后其生存率下降，并呈剂量依赖性（r=-0.930，P&<0.01），在浓度1.25， 2.5， 5， 10， 20，40 μg/ml时细胞生存率分别为：0.747±0.021，0.668±0.036，0.325±0.032，0.249±0.027，0.200±0.019，0.174±0.015；用相同DDP浓度处理不同时间，随着处理时间的延长，细胞生存率下降，并呈时间依赖性（r=-0.982，P＜0.01），其中在加药前，加药12，24和48 h，细胞生存率分别为：1.000±0.037，0.961±0.013，0.730±0.045和0.485±0.043。 在浓度2.5～5 μg/ml之间，DDP对细胞剂量-效应变化最为显著。

　　2.2 耐药相关基因的表达水平

　　肺癌细胞A549接触DDP后，MRP mRNA表达水平先降低后增高；MGMT mRNA表达水平下降；XPA和XPB mRNA表达均增高。肺癌细胞A549接触DDP 48 h时，MRP1，XPA和XPB mRNA表达的增高有统计学意义。这4种基因mRNA表达均有随DDP处理时间延长而增加的趋势（表1）。表1 DDP（4 μg/ml）处理前后耐药相关基因的表达水平

　　2.3 实时荧光定量PCR扩增耐药相关基因

　　如图1所示在相同条件下各耐药基因进行PCR反应的同时实时采集荧光数据得出的扩增曲线，图中的水平直线为5种基因共同达到的荧光阈值，其对应的横坐标即为各基因的循环次数。为检验各基因PCR产物的特异性，在扩增反应结束后制作熔解曲线，如图2所示各基因的熔解曲线均呈单峰，且波峰所对应的横坐标均大于80℃，说明各产物应该是PCR产物，不存在非特异性的扩增产物。

　　3 讨 论

　　DDP为金属铂的化合物，含有类似烷化剂的双功能基团，与细胞内亲核基团结合，主要作用靶点为DNA，作用于DNA链间及链内交链，形成DDP-DNA复合物，抑制DNA复制和转录，导致DNA断裂和错误编码，造成细胞死亡，DDP属周期非特异性药［1］。荷兰研究者选取27例接受DDP方案化疗的肺癌患者为研究对象，并用棉拭子取其颊黏膜细胞，采用免疫组织化学法，检测纺锤丝结合蛋白表达，以此间接测定DDP-DNA表达，结果发现，DDP-DNA高表达者达14例，且DDP-DNA高表达者中位生存期较低表达者明显延长，说明DDP可以通过作用于细胞DNA，进而抑制肿瘤生长，延长患者生存期［2］。

　　由膜转运蛋白介导的耐药是迄今研究最为广泛的一种肿瘤细胞耐药机制，该机制通过细胞膜上的蛋白将药物从细胞内泵出，减少肿瘤细胞内抗肿瘤药物的积累和滞留，使药物浓度低于治疗浓度的阈值，阻止肿瘤细胞的杀灭［3］ 。MRP1是肿瘤细胞膜转运蛋白的重要成员，相对分子质量190 kD，由1 531个氨基酸组成，MRP1基因位于第16号染色体长臂13.1带。MRP1可通过药物泵的作用，逆浓度梯度降低胞内药物浓度而导致耐药的发生。有研究显示非小细胞肺癌（NSCLC）中的87%和小细胞肺癌（SCLC）的56%高表达MRP1［4］。Ota等［5］检测104例NSCLC患者，发现MRP1高表达者生存期明显低于阴性表达者。本研究显示肺癌细胞A549经DDP处理后MRP1 mRNA的表达明显增高，表明DDP可诱导膜转运蛋白介导的肿瘤细胞耐药。

　　MGMT基因位于第10号染色体（10q26），编码含有207个氨基酸的MGMT蛋白，MGMT是修复DNA 损伤的一种十分重要的酶。可将烷化剂作用下形成的O6位甲基鸟嘌呤上的甲基转移到自身的活性半胱氨酸残基上，从而有效地修复DNA损伤，同时自身不可逆地失活。在这一过程中，MGMT不需要辅助因子和其他蛋白的参与。体内和体外试验均证明具有MGMT表达的肿瘤细胞明显比MGMT阴性的细胞对烷化剂的耐受性高［6］，但MGMT与DDP耐药的关系尚不明确。Mattern等［7］将14株肿瘤细胞系接种到裸鼠右腋下，分别注射环磷酰胺和顺铂，发现MGMT活性与肿瘤对环磷酰胺的敏感性呈负相关，而顺铂实验组未发现有此相关性。另有人研究了神经胶质瘤细胞体外药物敏感性与肿瘤细胞MGMT的表达之间的相关性，发现MGMT蛋白表达程度与血浆峰度下的三种甲基类药物DDP、乙基亚硝基脲（BUNU）和甲基亚硝脲（MeCCNU）对肿瘤细胞的抑制率呈显著性负相关，提示当肿瘤细胞内MGMT呈阳性表达时，将对包括DDP在内的这三种化疗药物耐药［8］，我们研究发现用DDP处理肺癌细胞时MGMT表达量是降低的，出现这一现象的原因还不清楚，需进一步研究。

　　NER是DNA修复损伤机制中最重要的途径之一，它主要参与修复紫外线诱导和化学物质引起的大片DNA损伤，维持基因组的稳定性，该途径包括识别、切开、切除、合成和连接5个步骤涉及约30种蛋白质［9，10］。XPA，XPB分别在该途径中对受损DNA的识别和切开发挥重要作用。XPA蛋白相对分子质量31 kD，基因位于第9号染色体（9q23.3），有6个外显子，所编码的蛋白XPA内包含锌指结构和多环亚结构，使DNA损伤片段识别蛋白，与受损DNA结合，且只特异性出现在NER途径中，缺失XPA基因的细胞NER功能受损最重，对多种因素造成的损伤修复能力下降［11］。采用XPA反义RNA技术降低细胞内XPA表达量，可以使肺癌细胞A549对DDP敏感性增加［12］。XPB基因位于第2号染色体（2q21），编码一段长782氨基酸的具有DNA解旋酶活性的蛋白质，该蛋白作为转录因子TFⅡH的一个亚基，通过结合于损伤DNA链的3′端，打开损伤位点附近DNA双螺旋，参与受损DNA的修复［11］。周李承等［13］用XPB反义RNA转染肺癌细胞A549后发现可以增加细胞对多柔比星的敏感性。本资料显示DDP处理后的肺癌细胞XPA和XPB mRNA表达量明显增高，反映了NER途径在肺癌细胞耐药机制中起了重要作用。

　　综上所述，我们的研究结果显示，DDP作用于肺癌细胞A549能引起耐药相关基因表达水平的改变，与3种耐药机制相关的4个耐药基因中，参与膜转运蛋白耐药机制的MRP1基因表达量先降低后增加；MGMT基因表达量降低；NER途径中的XPA，XPB基因表达量明显增加，表明多种耐药机制参与了DDP引起的肺癌细胞耐药。

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