维生素D和曲古菌素A对前列腺癌细胞骨桥蛋白表达及细胞生长的影响

【摘要】 目的:探讨维生素D[1，25(OH)2D3，VD3]联合曲古菌素A(TSA)对前列腺癌细胞中骨桥蛋白(OPN)表达及前列腺癌细胞生长的影响。方法：MTT和流式细胞术检测在不同浓度和时间下药物对前列腺癌细胞增殖和细胞周期的影响，并使用ELISA法检测在不同条件下前列腺癌细胞中OPN蛋白表达的变化。结果：VD3与TSA联合后对PC3细胞生长抑制率高于单独用VD3和TSA;VD3与TSA联合对PC3细胞周期的阻滞效果优于单独用VD3和TSA;VD3与TSA联合用药后，PC3细胞OPN表达水平比各单独用药组高，而DU145细胞未见明显变化。结论：TSA可增强VD3上调PC3细胞OPN的表达。而TSA和VD3联合使用对DU145细胞无论是上调OPN表达还是生长抑制作用都不太明显，说明PC3和DU145细胞对VD3不敏感的机制不同，这为临床治疗VD3不敏感肿瘤提供了新的选择。

【关键词】 维生素D; 曲古菌素A; 骨桥蛋白; 前列腺癌细胞

　　[Abstract] Objective: To investigate the effects of 1，25dihydroxy vitamin D3(VD3)and trichostatin A(TSA) on proliferation and osteopontin(OPN) expression in prostate cancer cells. Methods: MTT and flow cytometry were used to determine the effects of the drugs under different concentrations and time points on prostate cancer cell proliferation and cell cycle. The expression level of OPN protein in prostate cancer cells under different conditions and the concentration of OPN protein in culture supernatant were measured with ELISA. Results: The growth inhibition of PC3 cells was more obvious in the combination group of VD3 and TSA than that in VD3 or TSA alone group. Compared with the treatment of VD3 or TSA alone， combination of VD3 and TSA induced cell cycle arrest at G0/G1 phase in PC3 cells more effectively and upregulated higher levels of OPN protein in PC3， but no significant changes were found in DU145 cells. Conclusion: VD3 upregulates the OPN expression in PC3 cells，which is enhanced by cotreatment with TSA. Therefore the mechanisms of PC3 cells insensitive to VD3 may be related to the modification of histone acetylation.These findings provide novel chemotherapeutic regime for VD3insensitive cancers.

　　[Key words] vitamin D; trichostatin A; osteopontin; prostate cancer cells

　　近年来对维生素D[1，25(OH)2D3，vitamin D，VD3]与肿瘤的关系有广泛的研究。大量体内、体外实验显示，VD3对多种类型肿瘤如乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等细胞有较强的抑制增殖能力[1]，提示VD3单独或与其他配体联合作用将成为肿瘤预防与治疗的潜在药物。但VD3的抗肿瘤治疗存在一定的限制：一方面，大剂量的VD3可能会引起高钙血症和结石;另一方面，某些肿瘤细胞存在对VD3的抑制作用不敏感或抵抗的问题，例如，雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCaP对VD3较敏感，而雄激素非依赖性前列腺癌DU145和PC3细胞则不敏感[2]。对VD3不敏感的原因可能与基因表达的表观遗传学、VD3受体(vitamin D receptor，VDR)的多态性等有关。

　　人骨桥蛋白(osteopontin，OPN)是一种分泌性酸性糖蛋白，存在于细胞外基质。已证实OPN在人的许多肿瘤，包括肝癌、乳腺癌、前列腺癌、卵巢癌、脑癌和肺癌等[3]中过量表达，特别是易转移到骨骼的肺癌、乳腺癌和前列腺癌等。研究显示，在人和动物OPN的启动子区含有VD3反应元件(VD3responsive element，VDRE)成分[4-5]，因此我们选取OPN作为VD3加入前列腺癌细胞后研究的靶点。同样人前列腺肿瘤PC3细胞作为一种高表达OPN的细胞，同时存在对VD3不敏感的问题，因此成为本次试验很理想的研究对象。本研究主要从表观遗传学中的组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰入手，探讨VD3与组蛋白去乙酰化酶抑制剂曲古菌素A(trichostatin A，TSA)联合应用对前列腺癌细胞OPN的表达及细胞生长的影响。

　　1 材料与方法

　　1.1 主要试剂

　　VD3、TSA均购自美国Sigma试剂公司，四甲基偶氮唑蓝(MTT)为南京生兴生物试剂公司产品，F12培养基购自美国GIBCO BRL公司，ELISA试剂盒购自美国Uscnlife公司。

　　1.2 细胞培养

　　PC3细胞购自中国科学院上海细胞生物学研究所，DU145细胞由南京市第一人民医院病理科馈赠。两种细胞均置于含10%胎牛血清的F12培养基(含0.1%青霉素、链霉素)中培养，于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育。

　　1.3 MTT法检测细胞增殖

　　取对数生长期细胞常规消化接种于96孔培养板(2×104·孔-1)，待贴壁生长12 h后加入无血清F12培养液培养24 h使细胞同步化。然后按实验要求各实验组分别加入含有不同浓度TSA或VD3的培养液，其中TSA组TSA浓度分别为10-7、10-8及10-9 mol·L-1，VD3组VD3浓度分别为10-7、10-8及10-9 mol·L-1，联合用药组加入10-8 mol·L-1 的TSA和浓度依次为10-7、10-8、10-9 mol·L-1的VD3，对照组加入无水乙醇(终体积分数&<0.1%)。每孔均200 μl，各组设5个复孔，分别培养48、72、96 h，而后加入20 μl MTT (5 mg·ml-1)继续培养4 h，弃去各孔液体，每孔加150 μl DMSO，在酶标仪(Multiskan MK3353)上测定490 nm处吸光度值(A490值)。细胞生长抑制率=(1-实验组A490值的均值/对照组A490值的均值)×100%。

　　1.4 流式细胞术检测细胞周期

　　收集经TSA和VD3诱导的各实验组和对照组细胞，离心后PBS洗涤。然后按流式细胞检测说明操作并用流式细胞仪(FCM)检测，用Cell Quest软件收集数据，ModFit LT软件分析细胞周期分布。

　　1.5 OPN的ELISA检测

　　药物作用72 h后，用细胞裂解缓冲液将各组细胞裂解，离心后取上清液，按ELISA试剂盒操作说明检测OPN蛋白含量。

　　1.6 统计学处理

　　实验结果以±s表示，数据用SPSS 11.5软件包进行处理，组间均数比较采用单因素方差分析，P &<0.05为差异有显著性。

　　2 结 果

　　2.1 VD3和TSA抑制PC3和DU145细胞生长的作用

　　分别对PC3和DU145细胞单独使用不同浓度的VD3和TSA，分别检测其在48、72、96 h内细胞被抑制的情况。图1A显示3种不同浓度的VD3和TSA对PC3均有不同程度的抑制作用，这种作用呈浓度依赖性。同样图1显示不同浓度的VD3和TSA对PC3细胞抑制也呈时间依赖性，在48、72、96 h这3个时间段，两种药物分别对PC3细胞的抑制率逐渐增高。而图2显示，不同浓度的VD3同样对DU145细胞有不同程度的抑制作用，但没有PC3细胞对VD3那么敏感。

　　而后选择10-8 mol·L-1 TSA与不同浓度的VD3配伍同时处理PC3和DU145细胞，在48、72、96 h后，进一步观察单独用药组和联合用药组之间的差异。图3和图1比较后显示，在不同浓度下，联合用药组的抑制率明显高于VD3和TSA单独使用组(P&<0.05)。而对DU145细胞，图4和图2比较后显示，联合用药组与单独用药组相比，抑制率未见明显统计学差异。

　　2.2 VD3和TSA对PC3细胞周期的影响

　　流式细胞术检测10-7、10-8、10-9 mol·L-1的VD3使用72 h后对PC3细胞周期的影响。结果显示，10-7、10-8 mol·L-1两种浓度VD3对PC3细胞周期有一定的影响，主要表现为细胞在G1期发生阻滞。而VD3浓度在10-9 mol·L-1时与对照组差异很小。图5显示，使用10-7和10-8 mol·L-1 的VD3时，PC3细胞在G1期的细胞数比例(分别为71.67%±5.11%和63.28%±3.05%)明显高于对照组(为52.93%±2.23%)，(P&<0.05)而使用10-9 mol·L-1 的VD3时，PC3细胞在G1期的细胞数比例(为54.65%±3.07%)与对照组无太大差异。

　　观察单独使用10-7、10-8、10-9 mol·L-1的TSA 72 h后对PC3细胞周期的影响。图6显示，使用10-7和10-8 mol·L-1 TSA时PC3细胞在G1期的细胞数比例(分别为70.56%±7.03%和65.77%±4.24%)明显高于对照组(为45.86%±3.56%)，并且还出现了凋亡峰(TSA 10-7 mol·L-1时为23.49%±2.33%，10-8 mol·L-1时为21.70%±1.17%)。而使用10-9 mol·L-1 TSA时，PC3细胞在G1期的细胞数比例(为47.00%±2.31%)与对照组差异不大。

　　根据以上不同浓度VD3和TSA单独使用72 h后对PC3细胞周期影响的结果，选取10-8 mol·L-1浓度的TSA，观察其和3种不同浓度的VD3联合使用72 h后对PC3细胞周期的影响。图7显示，不同浓度的VD3与TSA联合使用对PC3细胞周期G1期阻滞的效果也不同，并且不同浓度的VD3和TSA联合使用组都高于VD3或TSA单独使用组。在不同浓度的VD3和TSA的联合使用的组与组之间也存在差异。两种药物联合使用对PC3细胞周期G1期阻滞的效果与VD3浓度成正比关系。但TSA和VD3联合用药与相对应VD3单独使用组比较，10-8 mol·L-1 TSA 加 10-8 mol·L-1 VD3组对G1期细胞阻滞的效果大于其他联合用药组(P&<0.05)。

　　2.3 ELISA检测PC3和DU145细胞中OPN蛋白的表达水平

　　根据MTT和流式细胞术检测的结果，选取10-8 mol·L-1 VD3和10-8 mol·L-1 TSA为实验浓度，然后使用ELISA试剂盒检测PC3、DU145细胞中OPN蛋白的表达水平，结果显示，VD3和TSA单独使用均能使两种细胞OPN蛋白的表达水平不同程度地升高，但这一现象在PC3细胞中更为明显(P&<0.05)。VD3和TSA联合作用于两种细胞的结果显示，OPN蛋白表达在PC3细胞中显著增高，而在DU145细胞中增加并不太明显。见表1。

　　3 讨 论

　　VD3在前列腺癌细胞中的生物学效应依然主要是通过其细胞核内受体VDR与靶基因上的DNA特异性核苷酸序列，即VDRE相互作用来介导基因的表达调控[6]。有研究认为，这种对VD3作用不敏感的机制与靶细胞中VDR有关，VDR表达量及功能的改变有可能影响到VD3发挥生物学效应[7]。本实验即探讨雄激素非依赖性前列腺癌细胞对VD3抑制作用敏感性的差异和对VD3不敏感的可能机制。同时也观察VD3作用于雄激素非依赖性的前列腺癌细胞OPN的改变及对细胞生长的影响。

　　组蛋白乙酰化/去乙酰化修饰所引起的染色质结构改变，在真核生物基因表达调控中发挥着重要作用。研究发现，肿瘤细胞的组蛋白大部分呈低乙酰化状态，表 1 ELISA法测定VD3和TSA使用72 h后培养液中OPN蛋白含量 而组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)异常活化所导致的基因表达失控(如某些抑癌基因的转录抑制) 与癌症的发生密切相关[8]。我们怀疑正是HDAC异常活化，并募集各种协同抑制因子，导致核小体结构紧密，阻遏VDR与VDRE的结合形成转录起始复合物，因而抑制了有关影响肿瘤细胞增殖的靶基因的转录，这可能成为雄激素非依赖性前列腺癌细胞对VD3的抑癌作用不敏感的重要因素。为了证实我们的猜想，我们通过MTT、使用ELISA试剂盒和流式细胞术来检测单独或联合使用VD3和TSA导致的前列腺癌细胞中OPN表达的改变和细胞生长的变化。实验发现，VD3与TSA合用后，PC3细胞的生长以及细胞周期均得到有效的抑制，并且比单独使用VD3组或TSA组有明显的提高，说明TSA和VD3之间有协同抑制作用。相比之下，DU145细胞单独使用VD3或TSA和联合使用，细胞的生长以及细胞周期的抑制并不太显著。同时我们在ELISA实验中发现，不加VD3时DU145细胞表达的OPN蛋白比PC3细胞少，这可能与不同细胞OPN表达的差异有关。我们联合使用VD3和TSA后，PC3细胞中OPN蛋白表达水平显著增高并高于两种药物单独使用的结果提示我们，VD3通过OPN的启动子区所含有的VDRE来调控OPN的表达，PC3细胞对VD3不敏感可能与基因的组蛋白修饰异常有关，而DU145细胞对VD3不敏感存在其他机制，并非基因的组蛋白修饰异常所致。

　　我们把ELISA实验结果和流式细胞术检测细胞周期的结果相比较，这时我们的实验出现了一个相互矛盾的现象。

参考文献

报道，我们提出可能的两种假设：其一，可能与OPN磷酸化有关。据文献报道，OPN磷酸化的程度不同其活性和功能也各不相同，这现象可能与OPN的磷酸化有关，VD3使细胞分泌的OPN是非磷酸化的，而这种非磷酸化的OPN不会导致细胞失去接触后生长抑制[9]。其二，有文献报道，VD3抑制肿瘤生长的机制可能包括调节βcatenin/Ecadherin和OPN途径。VD3能够抑制βcatenin/Lef1/Tcf信号途径并上调Ecadherin，从而抑制肿瘤并防止肿瘤转移。但同时VD3能增加OPN表达，而这两者之间是相互拮抗的，其中两者之间的作用机制还没完全研究清楚。有研究认为，使用低剂量VD3的抗肿瘤机制是，VD3抑制βcatenin/Lef1/Tcf信号途径，并且上调Ecadherin和增加OPN表达之间存在一个平衡。在低剂量时VD3发挥抑制βcatenin上调Ecadherin作用要大于增加OPN表达的作用，而体现出抑制肿瘤的作用[10]。

　　VD3治疗肿瘤存在一定的副作用，即长期高剂量的VD3会引起高钙血症或结石，Trump等人在用骨化三醇对43例确诊为雄激素非依赖性前列腺癌病人的临床治疗中发现，若以22 μg(约为52 nmol·L-1)的剂量给予14 d，将有30%的患者出现高钙血症的临床症状，而若以70 μg(约为168 nmol·L-1)的剂量治疗同样天数将导致几乎所有患者出现高钙血症[11]。因此，如何降低副作用的有害影响，又能达到抑制肿瘤的效果，从而提高VD3在治疗肿瘤方面的利用价值成为今后研究的方向。本实验采用低剂量的VD3与TSA配伍，既增强了VD3抑制肿瘤的效果，又避免了用高浓度VD3带来的副作用。

　　在今后的实验中仍有许多问题有待阐明，如：VD3的抗肿瘤作用和其提高OPN表达之间的机制，如何使用低剂量的VD3在降低其副作用的同时解决一些肿瘤对其的不敏感性，尽可能去除肿瘤对VD3的抵抗同时又能尽可能地发挥VD3的抗肿瘤作用。上述问题的解决，将有助于对OPN和VD3的深入认识，同时，对肿瘤的治疗和检测具有较大的临床意义。

参考文献

　[1] BEER T M，MYRTHUE A.Calcitriol in cancer treatment: from the lab to the clinic[J]. Mol Cancer Ther，2004，3(3):373381.

　　[2] LOU Y R， QIAOI S， TALONPOIKA R， et al. The role of vitamin D3 metabolism in prostate cancer[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2004，92(4):317325.

　　[3] 宋健，张东生，郑杰.肿瘤转移相关分子骨桥蛋白[J]. 东南大学学报:医学版，2004，23(3):206210.

　　[4] SODEK J. Osteopontin[J]. Crit Rev Oral Biol Med，2000，11:279303.

　　[5] SHEN Q， CHRISTAKOS S. The vitamin D receptor， Runx2， and the Notch signaling pathway cooperate in the transcriptional regulation of osteopontin[J]. J Biol Chem，2005，280(49):4058940598.

　　[6] BOUILLON R， EELEN G， VERLINDEN L， et al. Vitamin D and cancer[J]. J Steroid Biochem Mol Biol，2006，102(15):156162.

　　[7] ALAGBAL A A， MOSER M T， JOHNSONJ C S， et al. Characterization of vitamin D insensitive prostate cancer cells[J]. Steroid Biochem Mol Bio，2007， 103(35):712716.

　　[8] ZHAO X Y，FELDMAN D.The role of vitamin D in prostate cancer[J]. Steroid，2001，66(35):293300.

　　[9] van den BEMD G J， JHAMAI M， STAAL A， et al. A central dinucleotide within vitamin D response elements modulates DNA binding and transactivation by the vitamin D receptor in cellular response to natural and synthetic ligands[J]. J Biol Chem，2002，277(17):1453914546.

　　[10] CAMPBELL F C， XU H， ELTANANI M， et al. The Yin and Yang of vitamin D receptor(VDR) signaling in neoplastic progression: operational networks and tissuespecific growth control[J]. Biochem Pharmacol， 2010，79(1):19.

　　[11] TRUMP D L， POTTER D M， MUINDI J， et al. Phase II trial of highdose， intermittent calcitriol(1，25 dihydroxyvitamin D3) and dexamethasone in androgenindependent prostate cancer[J]. Cancer，2006，106(10):21362142.