等位基因特异性PCR技术在DEL表型基因分型中的应用

【摘要】 目的： 建立DEL表型的基因分型方法，用于快速鉴定DEL表型。方法： 用RH Box基因分型方法鉴定标本的基因型，用血清学方法确定标本的DEL表型。根据RHD 1227A等位基因序列设计等位基因特异性聚合酶链反应(allele specificpolymerase chain reaction，ASPCR)，用于DEL表型基因分型，结果同血清学的方法作比较，探讨临床应用的可行性。结果： 28例RH Box基因分型为RHD-/RHD-的标本，血清学方法、基因分型方法DEL表型鉴定结果均为阴性;在25例RH Box基因分型为RHD+/RHD-或RHD+/RHD+的标本中，用血清学方法检出的11例DEL表型标本，基因分型方法均扩增到867 bp的1227A等位基因条带;1例血清学方法阴性，而基因分型方法检测为阳性，后经测序分析证实RHD 1227A为阳性，分析此例标本可能为血清学方法漏检。这说明在鉴定DEL表型的方法中基因分型方法比血清学有更高的灵敏度。结论： ASPCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。

【关键词】 Rh血型 DEL表型; RHD 1227A等位基因; 基因分型

　　[Abstract] Objective: To establish a genotyping method for DEL phenotype of human blood group system.Methods： The genotype was determined by using genotyping method of RH Box， and DEL phenotype was determined by serological method. An allelespecific polymerase chain reaction(ASPCR) was designed for genotyping of DEL phenotype according to the sequence of the allele of RHD 1227A. The results achieved by the ASPCR method were compared with those by serological method， the feasibility of the genotyping method in clinical practices was evaluated. Results： Twentyeight RHD-/RHD- samples were negative by serological method and genotyping method for DEL phenotype. In 25 RHD+/RHD- and RHD+/RHD+ samples， 11 DEL phenotype positive samples were positive by ASPCR method. However， one DEL phenotype negative sample was positive by ASPCR method for DEL genotype. This sample was determined positive by sequencing analysis. Genotyping method for DEL phenotype had higher sensitivity than serological method. Conclusion： The ASPCR method can be used for screening DEL phenotype among the population negative of RHD antigen.

　　[Key words] Rh blood group DEL phenotype; RHD 1227A allele; genotyping

　　Rh血型系统中D抗原在输血医学中意义重大，重要性仅次于ABO血型系统。有研究表明黄种人和白种人个体RHD基因结构不完全相同。在黄种人中一些RhD(-)个体用吸收放散的方法仍能检测到D抗原，称之为D洗脱阳性(DEL)[1]。这种血液输给RhD阴性患者仍会产生D免疫反应[2]，因此对DEL抗原的免疫原性应予以重视。目前临床上DEL血型的检测常用吸收放散方法，由于试验步骤繁琐而不适用于临床大规模应用。因此如何快速有效地鉴定DEL表型已成为一个具有重要临床意义的课题。近年来研究发现，中国汉族人群DEL表型和RHD 1227A等位基因相关[3]。本研究根据RHD 1227A等位基因相序列，通过等位基因特异性PCR技术(allelespecific PCR，ASPCR)，建立了DEL表型基因分型的检测方法，能有效地检测DEL表型，现报告如下。

　　1 材料与方法

　　1.1 研究对象

　　至本中心血站献血的无亲缘关系的Rh阴性汉族献血者和至本站行产前检测的Rh阴性孕妇标本。

　　1.2 血型血清学试验

　　按卫生部《中国输血技术操作规程》进行红细胞RhD，C，c，E，e抗原的检测。间接抗球蛋白试验排除血样中的弱D和不完全D表型。IAT确认采用上海血液中心提供单克隆IgG抗D(clone:BS226，Bs232)，DIAGAST的单克隆IgG/IgM抗D(clone:P3×61+P3×21223B10+P3×290+P3×35)以及DBL NOVACLONE的单克隆IgG/IgM抗D(clone:4151E4+1752)。剩余血样通过吸收放散试验筛选DEL表型[4]。

　　1.3 DNA提取

　　抽取外周血5 ml，EDTANa2抗凝，采用试剂盒提取全血DNA(EZBDC血液基因组DNA快提试剂盒，济南泰天和生物科技有限公司)，分装-80℃保存备用。

　　1.4 RHD基因分型

　　采用RH Box基因分型试剂盒(G&&T，美国)PCR反应总体积9 μl，含7 μl PCR引物混合液，1 μl DNA样品，1 μl Taq酶(含0.33～0.5单位)。PCR扩增条件：95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 90 s，30个循环后置72℃再延长5 min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10 V/cm电泳30 min，结果通过凝胶成像仪(FR200A全自动紫外与可见分析装置，上海复日科技)拍照成像。

　　1.5 RHD 1227A基因分型

　　采用吴俊杰等[5]的方法根据RHD基因和RHD 1227A等位基因相关序列设计一组特异性扩增RHD 1227A等位基因的引物(上海生工生物技术公司合成)。RHDels:5′GACCAAGTTTTCTGGAAA3′(位置对应于AJ299028的6885)，RHDela:5′CGAGAGAATTTTGAGCAC3′( 位置对应于AB035185的849832)。一对特异扩增人GAPDH基因240 bp的引物作为内对照，GAPDHF:5′TGATGACATCAAGAAGGTGGTGAAG3′，GAPDHR:5′TCCTTGGAGGCCATGTGGGCCAT3′。总反应体积为10 μl，含模板DNA 0.2 μl，特异性引物终浓度250 nmol/L，内对照引物终浓度50 nmol/L，MgCl2终浓度1.5 mmol/L，dNTP终浓度200 μmol/L，Taq酶0.2 U。PCR扩增条件：95℃预变性5 min，然后95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 50 s，30个循环后72℃再延长5 min。使用0.5×TBE缓冲液，配制2%琼脂糖凝胶，以10 V/cm电泳30 min，结果通过凝胶成像仪拍照成像。

　　2 结 果

　　2.1 Rh表型确定

　　通过凝集试验和抗人球蛋白试验，筛选Rh阴性标本。血清学确定53例Rh阴性标本，其中ccdee 10例，带有RhC抗原的43例。

　　2.2 PCR检测RHD基因

　　用美国G&&T公司的RH Box基因分型试剂盒检测标本融合盒子(Hybird Rhesus Box)和下游盒子(Dwon Rhesus Box)。只带有融合盒子的为RHD基因完全缺失(RHD-/RHD-)，只带有下游盒子的为有2条染色体带有RHD基因(RHD+/RHD+)，同时出现融合盒子和下游盒子的为一条染色体带有RHD基因(RHD+/RHD-)，结果见图1。在10例表型为ccdee的标本中，RH Box基因分型都为RHD-/RHD-，在43例RhC阳性的RhD阴性标本中，检出18例RHD-/RHD-型，10例RHD+/RHD-型，15例RHD+/RHD+型。

　　1：RHD-/RHD-纯合子只显示下游盒子和融合盒子1508 bp条带;2，3：RHD+/RHD-杂合子，同时出现下游盒子和融合盒子1508 bp条带;M：DL2000标准参照物。内对照为429 bp

　　2.3 DEL表型的检测

　　在10例表型为ccdee的标本中，用血清学方法和基因分型的方法都未检测到DEL表型。在43例RhC阳性的RhD阴性标本中，18例未检测RHD基因的标本用血清学方法和基因分型的方法均未检测到DEL表型。在25例携带一条或两条RHD基因的RhD阴性标本中，用血清学方法检出11例DEL表型，这11例标本用基因分型方法均扩增到了867 bp的1227A等位基因条带，基因检测结果见图2。在这25例标本中有1例标本为血清学阴性，基因分型方法阳性。由于标本为陈旧性标本，无法重新进行吸收放散试验。由于吸收放散试验操作繁杂，步骤较多，同时操作者的不同判定的结果也会出现差异，因此可能为血清学法的漏检。后经上海生工生物技术公司对外显子9序列分析，结果为RHD 1227A阳性。结果见表1表1 RH Box基因型与DEL表型检测结果

　　3 讨 论

　　中国是个多民族国家，RHD基因的遗传背景十分复杂，DEL的遗传背景在中国汉族人和欧洲白人之间存在明显差异。根据近年来的研究结果表明，我国汉族人群DEL血型的分子基础是RHD 1227A等位基因[6]。因此本研究根据RHD 1227A等位基因序列，用ASPCR方法进行了DEL表型基因分型的检测。同时由于RHD基因的存在与RhC之间存在关联[7]，而DEL型的RHD基因基本完整。因此我们重点选择了RhC阳性表型的RhD阴性标本进行研究。

　　根据表1的结果，在28例RH Box基因分型RHD-/RHD-的标本中均未扩增到1227A等位基因，在25例携带一条或两条RHD基因的RhD阴性标本中，用血清学方法检出11例DEL表型，这11例标本用基因分型方法均扩增到了867 bp的1227A等位基因条带。这说明基因分型方法检测DEL表型和血清学方法相吻合。

　　在这25例标本中有1例标本为血清学阴性，基因分型方法阳性。由于标本为陈旧性标本，无法重新进行吸收放散试验，后经上海生工生物技术公司对此标本的外显子9序列分析，结果为RHD 1227A阳性。由于吸收放散试验操作繁杂，步骤较多，同时操作者的不同判定结果也会出现差异，因此此例标本可能为血清学法的漏检。这说明基因分型方法检测DEL表型和血清学方法结果还是一致的，同时这也提示基因分型的方法在灵敏度上高于血清学的方法，还有更好的重复性。

　　基因分型的方法可以有效地检测RHD 1227A等位基因，并且该方法有很高的灵敏度。因此对ccdee这些DEL表型阳性率比较低的标本可以通过检测多份样品的混合样来提高工作效率。

　　在中国汉族人中RhD阴性人群占0.2%～0.5%，这些RhD阴性人群中有很高比例的DEL表型，有文献报道中国汉族人中DEL表型占到RhD阴性人群的24.4%[8]。DEL虽然不表达正常的RhD蛋白，但还是可以表现为极弱的RhD抗原。到目前为止，临床上DEL表型的血液一直作为Rh阴性血液使用。最近已经有DEL血型血液输注给Rh阴性患者，从而导致抗D免疫事件发生的报道。因此在我国Rh阴性献血者中开展检测DEL血型很有必要，这是临床安全输血的重要保障。通过检测53例RHD 1227A标本，提示基因分型方法可以有效地检测RHD 1227A等位基因，同时基因分型的方法还可以利用血站的核酸检测系统实现自动化检测，这为临床上大规模开展DEL表型筛选创造了可能。

　　综上所述，ASPCR方法可用于临床筛选Rh阴性人群中的DEL表型。

参考文献

　[1] Okubo Y，Yamaguchi H，Tomita T，et al. A D variant， Del[J].Transfusion，1984，24(6):542.

　　[2] Wagner T，Komoczi GF，Buchta C，et al.AntiDimmuniza by DEL red blood cells[J].Tranfusion，2005，45(4):520-526.

　　[3] 陈安心，吕 豪，徐凤娟，等.浙江汉族RHD 1227A等位基因的五个家系遗传研究[J].中华医学遗传杂志，2006，23(5)：536-539.

　　[4] 刘达庄.免疫血液学[M].上海:上海科学技术出版社，2002:222-225.

　　[5] 吴俊杰，洪小珍，许先国.RHD基因测序方法的建立及其在弱D表型分子鉴定中的应用[J].中华检验医学杂志，2006，29(5):460-462.

　　[6] Shao CP，Maas JH，Su YQ，et al.Molecular background of RHDpositive，Dnegative，D(el) and weak D phenotypes in Chinese[J].Vox Sang，2002，83(2):156-161.

　　[7] 陈 强，陈 娟，李 政，等.中国部分地区RhD(-)汉族人RHD基因结构分析[J].中国输血杂志，2000，13(2):73-76.

　　[8] 张志梅，兰炯采.RhD阴性，Du，Del的检定及临床意义[J].中国免疫学杂志，2001，17(6):331-333.