维生素C对大鼠缺血再灌注肾组织MMP2表达的影响

　　　　作者：马尘超 陈永昌 贾俊海 臧璇 何悦成 姜蓉瑛 衣慧婷 李铁锋

【摘要】 目的： 观察维生素C（VitC)对大鼠肾脏缺血再灌注(RIR)基质金属蛋白酶2(MMP2)表达的影响，探讨其对RIR损伤保护的机制。方法： 48只雄性大鼠随机分成假手术组、RIR组和VitC组，比色法测定各组血清尿素氮(BUN)、肌酐(Scr)水平及肾组织丙二醛(MDA)水平、超氧化物歧化酶（SOD）、乳酸脱氢酶（LDH）活性；HE染色观察肾组织病理变化情况，并进行中性粒细胞计数；免疫组化法观察肾组织MMP2蛋白表达。结果： 与RIR组比较，VitC组血清BUN，Scr水平，肾组织匀浆MDA，LDH水平以及中性粒细胞计数均显著下降，而SOD活性显著升高；肾组织病理切片镜下显示RIR组大量肾小管结构缺损，变性，出血，坏死，VitC组较RIR组肾小管病变减轻明显；VitC预处理后，MMP2表达较RIR组肾小管显著减少。结论： 肾脏缺血再灌注时，MMP2参与介导了中性粒细胞对肾组织的浸润和自由基的活化，VitC可能通过降低MMP2在肾组织中的表达而减轻肾脏缺血再灌注损伤。

【关键词】 肾脏缺血再灌注损伤; 维生素C; 基质金属蛋白酶2

　　［Abstract］ Objective: To observe the changes of vitamin C(VitC) on the expression of MMP2 in rat after renal ischemia reperfusion(RIR) injury in order to elucidate the mechanism of its protective effect. Methods： Forty eight SD male rats were randomly pided into 3 groups: the sham operated(sham) group， the RIR group and the VitC group. The level of serum creatinine(Scr)， blood urea nitrogen(BUN)， the activity of renal SOD， LDH， and the content of MDA were detected respectively. Pathological changes of kidney were investigated by HE staining， the number of neutrophil(N) was counted and the expression of MMP2 in kidney was evaluated by immunohistochemical method. Results： In comparison with RIR group， both the levels of Scr， BUN， MDA and the activity of LDH were significantly lower， as well as the number of N， while the activity of SOD was obviously higher in the VitC group. There were significant pathological changes in renal tissue in the RIR group， which degeneration， congestion and necrosis were found in many renal tubules， however， fewer injuries were found in the VitC group compared with RIR group; the expression of MMP2 was significantly enhanced in renal tubules after RIR while it decreased dramatically in the VitC group. Conclusion： The adhesion of neutrophil to kidney and the activation of free radicals could be mediated by MMP2， and VitC may alleviate renal ischemia reperfusion injury through decreasing the expression of MMP2.

　　［Key words］ renal ischemia reperfusion injury; vitamin C; matrix metal proteinase2　　肾缺血再灌注(renal ischemiareperfusion， RIR)是临床常见的病理生理变化，常见于急性失血或中毒性休克、肾脏手术及肾移植术等过程中，其最主要的组织学变化表现为肾小管坏死或凋亡，细胞外基质(extracellular matrix， ECM)降解和间质中炎性细胞的浸润［1］。基质金属蛋白酶(matrix metal proteinases， MMPs)是一类含锌的可降解细胞外基质中多种蛋白成分的内肽酶家族，在许多生物活性物质(如细胞因子、自由基等)刺激下可异常表达，参与急性心肌梗死［2］、扩张型心肌病［3］、心力衰竭［4］等多种病理生理过程，造成基质破坏和血管通透性增加。近年来有人在对大鼠脑和心肌缺血再灌注的研究中发现MMPs参与了缺血再灌注损伤，但MMPs在肾脏缺血再灌注损伤后表达和活性的变化在国内还罕见报道。本实验拟通过观察MMP2在大鼠肾脏缺血再灌注的表达，以及维生素C(VitC)对其的影响，试图阐明VitC对肾脏缺血再灌注损伤保护作用的机理。

1 材料和方法

　　1.1 主要药品和试剂

　　尿素氮(BUN)、肌酐(Cr)、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)、乳酸脱氢酶(LDH)试剂盒均购自南京建成生物研究所；VitC注射液由南京金陵制药厂生产；MMP2抗体、SABC试剂盒、DAB显色试剂盒均购于武汉博士德生物有限公司。

　　1.2 动物模型及实验分组

　　选用雄性SD大鼠48只，体质量250～300 g(江苏大学实验动物中心提供)。RIR模型制备如下：实验前大鼠禁食12 h，不限饮水，术前30 min腹腔注射生理盐水6 ml/kg，后以5％戊巴比妥钠30 mg/kg腹腔麻醉，仰卧位固定，腹壁中线切开，上至剑突，下至耻骨联合，用浸温生理盐水的湿纱布包裹肠道，结扎右肾动、静脉后进行右肾切除，游离左肾蒂，以无创动脉夹夹闭肾动脉后开始计时，1 h后松开动脉夹，左肾由暗红逐渐变为鲜红，表明再灌注手术成功。缝合腹部伤口，放回鼠笼饲养，再灌注24 h。大鼠随机分为3组：(1)假手术组（n=16）：术前30 min腹腔注射生理盐水6 ml/kg，不夹闭肾动、静脉，其余同RIR模型制备。(2)RIR组（n=16）：即RIR模型制备。(3)VitC预处理组（n=16）：术前30 min腹腔注射VitC 6 ml/kg，其余同RIR组。

　　1.3 血清BUN，Scr和肾组织匀浆MDA，SOD，LDH的测定　　心室取血6～8 ml，3 000 r/min离心10 min，取上清，测Scr，BUN含量。并立即分离左肾，在冰生理盐水制成10%肾组织匀浆。测MDA，SOD，LDH含量。Scr，BUN，MDA，SOD，LDH均采用化学比色法，按试剂说明书操作，蛋白含量测定采用双缩脲法。

　　1.4 肾组织切片制备

　　每组16只大鼠中取8只用于低聚甲醛固定。先从腹主动脉注入生理盐水并将肾静脉剪开，后用4%低聚甲醛从腹主动脉注入直至肾组织发硬，再放入4%低聚甲醛中后固定，石蜡包埋，待做HE染色和免疫组化测定。

　　1.5 肾组织切片HE染色观察形态学变化

　　苏木精染30 s，水冲洗后伊红染色2 min，用水冲洗，中性树胶封固。病理切片分级标准［5］：“±”为基本正常；“+”为轻度损伤，被膜有炎细胞浸润，其余均轻；“++”为中度损伤，血管扩张充血、部分肾小管管腔内有红染蛋白物，偶见凋亡小体；“+++”为重度损伤，血管扩张，充血明显，较多肾小管管腔内有红染蛋白物及凋亡小体。

　　1.6 中性粒细胞计数

　　肾组织HE染色，组织切片，光镜100倍下对8个连续不重叠的视野进行中性粒细胞计数。

　　1.7 肾组织MMP2表达检测

　　免疫组化染色，采用SABC法检测，主要操作步骤为：石蜡切片常规脱蜡至水。3%h3O2灭活内源性过氧化物酶，BSA封闭，一抗为兔抗鼠MMP2多克隆抗体，工作浓度为1∶200，操作过程按试剂盒说明书进行，以PBS代替一抗作为阴性对照。胞质或胞膜显棕黄色沉淀为阳性表达。每张切片在400倍光镜下随机选择6个视野分别计数MMP2阳性细胞数，测定每个视野的阳性细胞数百分比，用平均值表示。

　　1.8 统计学处理

　　实验数据采用SPSS13.0软件对各组间差异进行方差分析和t检验。

2 结 果

　　2.1 血清中Scr和BUN的变化情况

　　与假手术组相比，RIR组血清Scr，BUN明显升高(P&<0.01)；VitC组Scr，BUN明显低于RIR组(P&<0.01)。见表1。

　　2.2 肾组织匀浆中MDA，SOD，LDH的变化情况和中性粒细胞计数结果　　与假手术组相比，RIR组肾组织匀浆MDA，LDH，中性粒细胞计数均明显升高(P&<0.01)，而SOD显著下降(P&<0.01)；VitC组MDA，LDH明显低于RIR组(P&<0.01)，中性粒细胞计数较RIR组减少(P&<0.05)，SOD较RIR组增高(P&<0.05)。见表2。

　　2.3 肾组织形态学观察结果

　　与假手术组相比，RIR组分级为“±”的肾脏明显减少(P&<0.01)，分级为“+++”的肾脏明显增多(P&<0.01)；与RIR组相比，VitC组分级为“+”，“++”的肾脏增多(P&<0.05)，分级为“+++”的肾脏减少(P&<0.05)。见表3。表1 各组大鼠血清Scr，BUN的变化情况 表2 各组大鼠肾组织匀浆中MDA，SOD，LDH的变化情况表3 各组大鼠肾组织形态学观察结果

　　2.4 肾组织MMP2表达情况

　　假手术组MMP2蛋白在肾组织微量表达，其阳性细胞百分率为(4.56±0.16)％；RIR组MMP2蛋白表达以皮质深层受损肾小管及肾小球周边的小管上皮细胞为主，与假手术组比，表达明显增加(P&<0.01)，其阳性细胞百分率为(35.42±7.24)％；VitC组与RIR组相比，MMP2蛋白表达减少较为明显(P&<0.05)，其阳性细胞百分率为(18.37±2.12)％。见图1。

3 讨 论

　　MMPs是一组降解细胞外基质成分的钙、锌依赖性肽链内酶和蛋白水解酶，现已发现23种MMPs，称为MMP家族［6］。MMP2属明胶酶即明胶酶A，是锌离子依赖性内肽酶，可由正常组织细胞产生，也可由炎症细胞或肿瘤细胞生成。本实验采用免疫组化法研究缺血再灌注肾组织MMP2蛋白水平的变化，发现RIR组MMP2在再灌注后24 h表达显著增加，主要位于肾小管上皮细胞，尤其是皮质深层肾小管及肾小球周边的近曲小管，而且发现MMP2的高表达与反映肾功能下降的指标BUN，Scr高水平相一致，从形态学观察结果也表明MMP2表达越高，肾组织损伤越明显。因此，MMP2的高表达在肾缺血再灌注损伤中起一定作用。

　　MMP2在肾缺血再灌注损伤中的作用可能与其介导了中性粒细胞的激活并产生大量氧自由基有关。实验中我们发现，RIR后MMP2表达异常增高，中性粒细胞浸润数量也明显增多，这可能与MMP2对血管基底膜的降解有关。细胞外基质是一种多功能蛋白和糖蛋白的复合体，是细胞生存的重要内环境，其在生理状态下处于一种快速更新代谢的动态平衡中，平衡失调会导致组织结构的破坏。在肾组织，细胞上基质为血管和肾小管提供支持结构，参与构成基底膜。而MMPs是降解细胞外基质的重要酶系，可降解细胞外基质的各种成分，其中MMP2可能会降解构成肾小管基膜(tubule basement membrane， TBM)的主要成分纤维连接蛋白和层黏连蛋白［7］。当肾小管基底膜被高表达的MMP2降解时，则成为白细胞浸润的必要条件，同时细胞外基质的降解碎片可以作为白细胞的趋化因子和协同激活因子而促进白细胞的聚集、溢出和活化。实验中我们还发现反映氧自由基升高的MDA以及细胞损伤的LDH显著升高。因为激活的中性粒细胞在吞噬活动时耗氧量显著增加［8］，产生大量氧自由基。氧自由基可引发脂质和蛋白过氧化，从而产生大量MDA；损伤细胞器和细胞膜，则导致血清中LDH活性升高。SOD是一个重要的抗氧化酶，可以歧化生成h3O2，其重要意义在于清除h3O2和OH-的前身，从而保护细胞不受毒性氧自由基的损伤［9］。

　　缺血再灌注后MMP2表达异常的机制目前尚不清楚，Rosenberg等［10］认为诸多细胞因子均对MMP mRNA的表达有调节作用，但具体机制尚在探索阶段。VitC是一种既能化学合成又广泛存在于天然动植物中的水溶性维生素，具有许多重要的生物学功能，例如维持中枢神经系统和心血管系统的功能和免疫调节作用。VitC在体内的抗氧化作用虽已被证实，但有关VitC在肾脏缺血再灌注中的作用及机制尚不十分清楚。本实验结果显示使用VitC后，血清BUN，CR，肾组织MDA，LDH含量均降低，而SOD活性明显升高，镜下显示肾小管破坏程度明显减轻，说明VitC对肾缺血再灌注损伤有保护作用。我们发现VitC组MMP2的表达较RIR组也有显著下降，提示VitC也可能通过降低MMP2的表达从而对肾缺血再灌注损伤有保护作用，同时VitC可以结合自由基，从而减轻自由基对组织细胞和细胞膜的破坏，但VitC具体影响MMP2的表达的机制还有待于进一步的研究。

　　综上所述，MMP2的异常表达可能是引起肾脏缺血再灌注损伤的机制之一，过量的MMP2可以通过破坏细胞外基质和产生大量氧自由基引起肾脏缺血再灌注损伤，VitC可能通过降低MMP2在肾组织中的表达从而达到对肾脏缺血再灌注的保护作用。

参考文献

［1］ AlfonsoJaume MA， Bergman MR， Mahomkar R，et al. Cardiac ischemiareperfusion injury induces matrix metalloproteinase2 expression through the AP1 components FosB and JunB ［J］. Am J Physiol Heart Circ Physiol， 2006， 291(4):H1838-H1846.

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［6］ 杜孝文，吴小候，余晓东，等. p38MAPK对大鼠肾缺血再灌注损伤早期MMP9表达的调控［J］. 重庆医学，2007，36(14):1368-1371.

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［8］ 贾俊海，陈素仙，陈永昌. 肾脏缺血预处理对心肌缺血再灌注粘附分子表达的影响［J］. 江苏大学学报:医学版，2005，15(5):384-387.

［9］ Chung SY， Wang MF， Lin JY，et al. Effect of one week treatment with ginkgo biloba extract(EGb761) on ischemiainduced infarct volume in gerbils ［J］. Am J Chin Med， 2003， 31(4):553-542.

［10］ Rosenberg GA， Cunningham LA， Wallace J，et al. Immunohistochenistry of MMP9 linked to stromelysin1 and microglia in cell cultures ［J］. Brain Res， 2001， 893(1-2):104-112.