嗅鞘细胞移植后脊髓半横断大鼠睫状神经营养因子和FGF2表达的变化

　　　　作者：毕文杰 章为 王廷华 朱振东 王健 马玉琼 郑翔 周雪

【摘要】 目的： 研究嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells， OECs）移植到损伤的脊髓后，能否分泌睫状神经营养因子（CNTF）和碱性成纤维细胞生长因子（FGF2），以及能否引起脊髓组织内CNTF和FGF2表达的变化及脊髓的细胞有何数量改变。方法： 体外分离培养大鼠嗅球嗅鞘细胞，通过免疫荧光细胞化学染色检测其CNTF和FGF2的表达。将嗅鞘细胞移植入脊髓半横断SD大鼠，观察术后7天和21天嗅鞘细胞在脊髓内的存活情况，并对脊髓组织切片进行CNTF和FGF2免疫荧光组织化学染色，计数阳性细胞并计算阳性面积百分比。结果： 嗅鞘细胞在体外培养和移植后都能表达CNTF和FGF2。同未移植组对比，移植组脊髓CNTF和FGF2表达明显增强（P＜0.05），神经元和少突胶质细胞数量增加(P＜0.05)，星型胶质细胞数量无明显改变。结论： 嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后能分泌CNTF和FGF2，并使脊髓组织内CNTF和FGF2的表达增加，引起神经元和少突胶质细胞数量增加。

【关键词】 脊髓损伤； 嗅鞘细胞； 移植； 睫状神经营养因子（CNTF）； 碱性成纤维细胞生长因子（FGF2）

　　［Abstract］ Objective: To investigate whether olfactory ensheathing cells(OECs) could secret ciliary neurotrophic factor(CNTF) and basic fibroblastic growth factor(FGF2)， and make expression change of them when planted in the spinal cord， then count the change of number for spinal cord cells. Methods： To culture and identify the rat OECs. We detected the expression of CNTF and FGF2 by immunofluorescence cytochemistry in OECs cells. OECs were transplanted into the hemisectioned spinal cord of adult SD rats and their survival condition was observed at 7th days and 21st days after transplantation. The CNTF and FGF2 positive cell number and the positive area percentage， as well as the number of neuron and neuroglia calculated by immunofluorescence analysis in the spinal cord. Results： OECs could express CNTF and FGF2 in vitro and in viro post transplantation. Significantly higher levels of CNTF and FGF2 expression were detected compared with control(mediuminjected）rats（P＜0.05）. The number of neuron and oligodendrocyte increased dramatically surrounding the wound（P＜0.05）， but not astrocyte. Conclusion： Posttransplanlation， OECs secreted CNTF and FGF2， and increased expression of CNTF and FGF2 and the number of neuron and oligodendrayte in the spiual cord.

　　［Key words］ spinal cord injury; olfactory ensheathing cell; transplantation; ciliary neurotrophic factor; basic fibroblast growth factor

　　脊髓损伤后出现神经元死亡、轴突脱髓鞘、少突胶质细胞丢失等一系列反应，造成轴突的再生失败。神经营养因子供给不足以及胶质瘢痕的形成可能构成了抑制轴突再生的主要因素。尽管如此，轴突在合适的环境中仍可能恢复再生的能力。为了营造适合再生的组织环境，嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells， OECs）移植成为一项很有希望的治疗手段。有实验研究证实，嗅鞘细胞移植后能促进损伤脊髓恢复功能并保护神经细胞［1］。虽然嗅鞘细胞在神经保护和促进再生方面的机制还未完全阐明，但其分泌的神经营养因子有可能起关键作用。已知原代培养的嗅鞘细胞能分泌多种营养因子，包括神经生长因子、神经营养素-4/5、神经调节蛋白、脑源性神经营养因子等。有研究表明，嗅球中睫状神经营养因子（ciliary neurotrophic factor， CNTF）在嗅鞘细胞的胞核、胞质和突起中表达［2］。此外，嗅鞘细胞在体内还能合成碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor， FGF2)［3］。但目前还没有关于嗅鞘细胞移植和CNTF，FGF2关系的报道。CNTF和FGF2都能保护神经元，减少其死亡，尤其CNTF能促进不同类型的神经元存活。此外，CNTF和FGF2还对少突胶质细胞系起重要的作用，前者能促进少突胶质前体细胞（oligodendrocyte precursor cells，OPCs）的成熟与分化，促进少突胶质细胞合成髓磷脂蛋白，并且防止少突胶质细胞的凋亡［4］；后者能促进少突胶质前体细胞的增殖和迁移，两者具有协同作用。因此，这两种因子在脊髓损伤后对少突胶质细胞的存活及增殖分化起了重要作用。然而，既往的研究报道都是分别关注脊髓损伤后移植嗅鞘细胞的疗效和CNTF与FGF2对损伤修复的促进作用，还没有关于嗅鞘细胞移植后能否在体内表达CNTF，FGF2，并引起脊髓这两种因子的表达变化，以及这两种因子对脊髓组织神经元和胶质细胞数量有何影响的报道。为了研究这个问题，我们将嗅鞘细胞移植到SD大鼠的脊髓半横断损伤部位，检测嗅鞘细胞是否能在体内表达CNTF和FGF2，并观察这两种营养因子在脊髓表达是否增强。由于这两种因子对神经元有保护作用，且对少突胶质细胞的存活和增殖有促进作用，因此本实验还检测了移植后神经元和少突胶质细胞的数量变化。

1 材料和方法

　　1.1 嗅鞘细胞纯化培养及纯度鉴定

　　按照李绍波等［ 5］的方法进行。无菌条件下取1月龄的SD大鼠嗅球最外两层， 经分散后将细胞种植于含20%胎牛血清的DMEM/F12培养基中。采用差速贴壁和阿糖胞苷抑制相结合的方法培养。在培养第14天行胶质原纤维酸性蛋白(GFAP) 和神经生长因子受体(NGFRp75) 的免疫细胞化学染色鉴定， 并计算嗅鞘细胞的纯度。

　　1.2 免疫细胞化学染色

　　培养第14天进行免疫细胞化学染色。用多聚甲醛固定细胞，CNTF和FGF2免疫荧光细胞化学染色（兔抗FGF2，1∶200，博奥森；兔抗CNTF，1∶200， USCN life Science && Technology Company；羊抗兔二抗IgG，1∶100， 博奥森），用Zeiss荧光显微镜观察照相。

　　1.3 嗅鞘细胞核荧光及细胞悬液的制备

　　参照朱振东等［6］的方法进行。加入Hoechst33342溶液孵育30 min，用胰蛋白酶消化及机械分离，制备浓度为10×106个/ml细胞悬液。嗅鞘细胞标记后，在荧光显微镜下观察，细胞核呈蓝色荧光。

　　1.4 大鼠半横断损伤模型的建立及嗅鞘细胞移植

　　成年SD大鼠，体质量（270±20）g，T11～T12脊髓节段间用虹膜剪横断左侧半脊髓。为确保半横断，可用尖刀片在左侧半横断处来回切割2～3次，彻底止血后将明胶海绵填充在半横断处。动物随机分为两组，每组20只。移植组（注射细胞组）：损伤后在立体定位仪下用微量加样器（Hamilton）连接的玻璃针（80 μm i.d;100 μm o.d）立即将准备好的细胞悬液注射到横断处头﹑尾两侧1.0 mm﹑距中线0.5 mm处。注射深度分别为1.75，1.25和0.75 mm，每点在约30 s内注射2 μl，另在横断处注射8 μl，共注射12 μl。对照组（注射无血清培养液组）：方法同移植组。

　　1.5 标本处理和免疫荧光组织化学染色

　　术后7天和21天，动物取材，固定，脱水。用冰冻切片机作脊髓（纵切）的连续切片，片厚20 μm，每组动物取5张切片。切片用2%的牛血清白蛋白封闭15 min。然后切片置入一抗内孵育。切片所用一抗为：兔抗GFAP(1∶200， Sigma)，用来标记星型胶质细胞；小鼠抗NeuN(1∶1000， Chemicon)， 用来标记神经元；兔抗MBP(1∶200， Chemicon)，用来标记少突胶质细胞。切片置入荧光素标记的二抗孵育。所用二抗为：马抗小鼠IgG(1∶100， 博奥森)。其他同前。用Zeiss荧光显微镜观察照相，每张切片取损伤边缘头侧、尾侧和对侧3个视野拍照。10×10放大倍数下每张照片实际面积为1.44 mm2；10×20倍数下为0.40 mm2。面积测量借助显微目镜测量尺进行（Leitz，7988c）。

　　1.6 实验数据分析

　　图片用联机ImagePro 5.0系统做图像分析，所得各组数据用±s表示；细胞移植组与对照组的数据比较用分组t检验，统计分析软件采用SPSS11.5，数据导入Excel2003作图。P&<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

　　2.1 嗅鞘细胞在体外表达CNTF和FGF2

　　免疫荧光细胞化学染色显示，培养第14天，嗅鞘细胞的核和胞质呈明显的CNTF与FGF2阳性（图1）。

　　2.2 嗅鞘细胞的存活情况

　　移植后7天、21天在脊髓切片中均可观察到大量蓝色细胞核即移植的嗅鞘细胞的细胞核，细胞核数量未见减少，形态正常，未见核固缩和核碎裂。说明嗅鞘细胞移植后在脊髓存活良好。

　　2.3 嗅鞘细胞移植后在体内表达CNTF和FGF2

　　嗅鞘细胞移植入损伤的脊髓后，CNTF和FGF2可在部分细胞的胞核和胞质中检测到（图2），说明移植的嗅鞘细胞能够表达CNTF和FGF2。

　　2.4 移植前后脊髓T10节段CNTF和FGF2表达变化

　　手术后7天和21天，脊髓横断处的周边组织均可见CNTF和FGF2表达。移植组CNTF和FGF2的表达都明显高于对照组（P&<0.05）。见图3。

　　2.5 移植前后神经元、星型胶质细胞和少突胶质细胞数量的变化

　　术后7 天和21天，移植组神经元和少突胶质细胞的数量高于对照组（P＜0.05），星型胶质细胞的数量和对照组没有明显差异（P＞0.05）。见图4，5。

3 讨 论

　　 本实验将嗅鞘细胞移植入大鼠半横断脊髓后，检测发现嗅鞘细胞在体内表达CNTF和FGF2，并且使得这两种因子在脊髓组织中的表达比对照组高。此外，细胞移植组神经元和少突胶质细胞的数量也比对照组多，而星型胶质细胞数量没有明显改变。

　　OEC移植入成年大鼠的脊髓损伤处能促进功能的恢复和轴突的再生，形态学观察到它们桥接在损伤导致的空洞处，促进轴突穿过病变区，并且形成髓鞘围绕再生的或脱髓鞘的轴突，来增强轴突的传导性［7］。我们的前期工作从行为学、电生理和追踪等观察到嗅鞘细胞可促进损伤脊髓的功能恢复［6］。但其作用机制还不清楚，推测嗅鞘细胞能合成某些特殊的细胞外基质和营养因子来支持轴突的黏附和生长［8］。

　　很多神经营养因子已被报道在脊髓损伤（spinal cord injury， SCI）后对神经有保护作用。CNTF mRNA在脊髓半横断损伤后1～3天增加，然后在10～14天后降低［9］。另外，Lee等［10］发现脊髓半横断后，CNTF在术后7天达到最大值，然后在14天降低到基线水平。脊髓损伤后，FGF2最早在6 h内增加，在7天后还很明显。增加的FGF2主要局限在损伤的中心部位，7天后仅仅在损伤位置的头侧端可见。这些营养因子的持续表达可能对组织的修复有很重要的作用。但是嗅鞘细胞移植后，对脊髓组织的CNTF和FGF2表达影响的研究几乎未见报道。在本实验中，我们观察到了原代培养的嗅鞘细胞 能表达CNTF和 FGF2。这与Kenta 等［11］的结果一致，但是有报道说明同种的克隆细胞系的嗅鞘细胞(nOECs) 不表达CNTF的mRNA［12］。这与我们的结果不一致，可能nOECs的生物学特征发生了改变。我们还观察到嗅鞘细胞移植后，脊髓内这两种因子的表达增强，尤其在移植21天后表达还明显高于对照组。一方面，移植的嗅鞘细胞在体内表达CNTF和FGF2；另一方面，移植后，脊髓本身的组织表达这两种因子增强。这两种因子在脊髓的表达增强可能对脊髓的神经元、少突胶质细胞和星型胶质起了重要的影响。

　　脊髓损伤后，神经元的变性和死亡是最严重的。而营养因子对神经元的保护作用是很有效的。CNTF和FGF2都能保护神经元，减少其死亡，尤其CNTF能促进不同类型的神经元存活， FGF2可以在实验性脊髓损伤后，增强脊髓运动神经元长期的存活。我们的研究发现，移植后，不仅嗅鞘细胞表达CNTF和FGF2，脊髓本身表达这两种因子的水平也上调，它们可能对神经元起一定的保护作用。同时嗅鞘细胞能合成并分泌多种生长因子来促进不同类型的神经元的存活和再生［13］，如脑源性神经营养因子和胶质细胞源性神经营养因子可以在损伤后保护运动神经元［14］。所以CNTF和FGF2可能是协同其他的因子一起对神经元起保护作用的。大鼠脊髓半横断损伤后，少突胶质细胞（Oligodendrocytes， OLs）的丢失持续一段较长的时间，在损伤空洞处只剩下很少的OL。关键存活因子的丢失和毒性因子的产生在这过程中起了很重要的作用。而营养因子的支持对OLs的存活很关键。体内和体外的研究都证实了CNTF和FGF2对OLs的存活很重要。已知CNTF能够促进OLs的存活，包括促进其前体细胞的分化，并且能促进髓磷脂的形成［15］。它可以降低少突胶质细胞的凋亡和宿主白质纤维束的丢失，并促进裸露轴突的再髓鞘化。另外，CNTF在成年人的髓鞘形成中也可能起作用，因为它在再髓鞘化的病变区内和周围表达上调［16］。FGF2能够阻止少突胶质细胞的凋亡。在成年人的中枢神经系统，尤其在再髓鞘化的过程中，FGF2是OPCs有力的分裂素，可促进OPCs的增殖。另外，FGF2可以增加髓磷脂碱性蛋白的表达和促进成熟少突胶质细胞的髓磷脂的压缩，并且可以降低脱髓鞘化后髓磷脂样膜的重建。这些发现提示，在脱髓鞘化的过程中FGF2可能参与了OLs的再生和髓磷脂修复的过程。我们的研究显示，嗅鞘细胞移植后，CNTF和FGF2的表达明显上调，这些因子保护OLs并促使OPCs的成熟与分化，使得OLs的数量明显增加。OLs可以产生更多的髓磷脂，这对轴突的再髓鞘化十分有用，并且新生的OLs所形成的再髓鞘化可能有助于运动功能的恢复［17］。OLs形成髓鞘后，能保护轴突并且有助于神经冲动的传导。因此，OLs的再生、分化和存活对髓鞘再生是十分必要的。脊髓损伤后，活化的星型胶质细胞是很明显的，但是它们的作用还不是很清楚。有证据显示星型胶质细胞可能对组织的保护作用很重要。星型胶质细胞能清除细胞外间隙的谷氨酸和钾离子，并且可以产生大量的生长因子和细胞因子。星型胶质细胞持续的存在并且合适地调节其功能可能对SCI很重要，活化的星型胶质细胞对伤口的愈合和血脑屏障的修复是必须的，可以限制炎症反应，保护神经元和少突胶质细胞及髓磷脂，促进运动功能的恢复。有相反的证据提示星型胶质细胞所形成的胶质瘢痕能抑制轴突的再生［18］。但是，嗅鞘细胞移植后能产生一个三维空间为轴突的再生提供一个良好的微环境［19］。并且，大量的证据显示，在体内嗅鞘细胞和星型胶质细胞的突起融合在一起，减少了由星型胶质细胞所诱导的硫酸软骨素蛋白的上调［20］。有研究发现嗅鞘细胞移植后，星型胶质细胞的形态变得比较瘦小，突起细小，并且形成了整齐的网状结构［21］。在我们的实验中，嗅鞘细胞移植后，星型胶质细胞的数量没有明显改变，也未观察到星型胶质细胞的形态改变，可能通过电镜或者共聚焦显微镜才能更好地观察其形态的改变。

　　综上所述，本研究说明嗅鞘细胞可能通过调节CNTF和FGF2的表达来增加神经元和少突胶质细胞的存活，这些有助于脊髓损伤后功能的恢复。本实验结果为进一步探讨嗅鞘细胞的作用机制积累了更多的实验依据。

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