三七超细粉体对兔缺血再灌注心肌ICAM1蛋白表达的影响

　　　　 作者：朱晓奕 周亚平 吴建农 辛淮生 傅海珍

【关键词】 三七超细粉体； 缺血再灌注损伤； 细胞间黏附分子1

目前，缺血心肌再灌注治疗的技术如溶栓治疗，经皮冠状动脉腔内成形术和冠状动脉旁路移植术等仍是治疗缺血性心脏病普遍采用的措施［1］。但是国内外大量的研究表明，缺血再灌注后已经受损的心肌不一定能恢复正常的功能和结构，甚至还会出现损伤加重的表现，如再灌注心律失常，心肌顿抑，内皮损伤等。探索防治心肌缺血再灌注损伤的药物是当今医学研究热点之一。中药三七是五加科人参属多年生草本植物三七的根。多项实验证实普通三七粉及提取物三七总皂苷（Panax notoginseng saponins，PNS）对大鼠、家兔、犬的心肌缺血再灌注损伤有较强的保护作用［2-4］。细胞间黏附分子1（intercellular adhesion molecule1， ICAM1)是一种很强的蛋白类致损因子，在缺血再灌注心肌细胞表面ICAM1量可成倍增加［5］。本研究利用兔心肌缺血再灌注模型，以心肌ICAM1蛋白表达为指标，进一步研究经超细粉碎的三七超细粉体对缺血再灌注心肌损伤的影响，为中药剂型改革以防治再灌注损伤提供实验依据。

1 材料与方法

　　1.1 动 物

　　健康成年日本大耳白兔40只，雄性，体质量2.0～2.5 kg，由江苏大学医学院实验动物中心提供。实验前饲养于安静通风、光线充足的环境中，室温15℃～25℃。

　　1.2 药品与试剂

　　三七为云南产，经作者鉴定为Panax notoginseng（Burk）F.H.Chen的根。三七超细粉体，系三七超微粉碎，由南京理工大学化工学院加工，粒径20 μm以下；三七颗粒，由江苏大学药学院制备，普通粉碎机粉碎，过40目筛。ICAM1抗体及免疫组化试剂盒，购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.3 方 法

　　1.3.1 实验分组 将40只兔随机分为5组，每组8只。假手术组：每天以生理盐水4 ml/kg连续灌胃7 d，末次灌胃1 h后行手术；缺血再灌注组：处理同假手术组；三七颗粒组：以三七颗粒0.6 g/kg溶于生理盐水4 ml中，以4 ml/kg连续灌胃7 d后处理同假手术组；三七超细粉体小剂量组：以三七超细粉体0.3 g/kg溶于生理盐水4 ml中，处理同三七颗粒组；三七超细粉体大剂量组，以三七超细粉体0.6 g/kg溶于生理盐水4 ml中，处理同三七颗粒组。

　　1.3.2 动物模型的制备［6］ 3%戊巴化妥钠30 mg/kg耳缘静脉注射麻醉，仰卧固定，常规记录肢体Ⅱ导联心电图。沿胸部中线纵切皮肤，显露胸骨和软骨部分，沿左胸骨边缘切断3，4肋软骨，避免损伤胸膜和胸廓内血管，维持自主呼吸，显露心脏，剪开心包膜，于左冠状动脉前降支近起始部6～8 mm处穿一30丝线，假手术组只穿线不结扎，余组用丝线结扎阻闭血管，以心电图Ⅱ导联ST段升高，T波高耸，结扎线以下心肌组织颜色由正常变苍白再变暗为心肌缺血造模成功，30 min后松开血管，恢复左前降支血流，再灌注60 min，摘取心脏。

　　1.3.3 ICAM1蛋白表达水平测定 取各组左心室处心肌组织冷冻切片，进行免疫组化反应染色，严格按说明书操作，DBA显色，显微镜观察，阳性颗粒呈棕黄色，结果采用计算机医学图像分析仪处理，测定ICAM1蛋白阳性心肌面密度值。

　　1.3.4 统计学方法 采用SPSS11.5统计分析软件，数据以均数±标准差（±s）表示，均数的比较用F检验，各组间差异用q检验。P&< 0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

　　各组缺血再灌注心肌ICAM1蛋白表达的变化见表1。结果表明，结扎冠状动脉30 min，再灌注60 min后各组心肌ICAM1蛋白表达显著高于未结扎的假手术组，应用三七颗粒及三七超细粉体（大、小剂量）预处理的组别ICAM1蛋白表达明显低于缺血再灌注组。三七超细粉体大、小剂量两组ICAM1蛋白表达又明显低于三七颗粒组。三七超细粉体大、小剂量两组之间比较差异无统计学意义。表1 各组再灌注60 min后 ICAM1蛋白表达

　　3 讨 论

　　三七的主要活性成分为三七总皂苷，现代药理研究表明，三七总皂苷具有明显地降低心肌耗氧量、改善心肌缺血、降血脂、防止动脉粥样硬化、抗心律失常等作用［7，8］。目前微粉化技术在中药材中不断得到运用，我们前期的对比研究表明三七超细粉体有效成分的溶出度明显优于三七常规颗粒，证实了微粉化技术在三七应用中的可行性。

　　ICAM1属于免疫球蛋白超基因家族，在血管内皮表达量最高。心肌细胞在正常情况下仅有极少量ICAM1表达，但在心肌缺血再灌注时，心肌细胞膜表面的ICAM1量成倍增加［5］。ICAM1表达增高导致中性粒细胞浸润增加，心肌组织细胞损伤加剧。使用ICAM1单抗或ICAM1表达抑制剂能起到心肌保护作用。研究表明，三七总皂苷能抑制心肌缺血再灌注时ICAM1表达的增高，从而起到心肌保护作用［9］。本实验结果表明，假手术组相比，各缺血再灌注组心肌ICAM1蛋白表达明显升高，说明心肌缺血再灌注时有大量ICAM1蛋白表达，与心肌损伤关系密切。三七预处理各组ICAM1蛋白表达均减少，而三七超细粉体较三七颗粒具有更强的降低ICAM1蛋白表达的效果，说明与普通三七颗粒相比三七超细粉体可以通过减少ICAM1蛋白表达而更有效地减轻心肌缺血再灌注损伤，起到心肌保护作用。

　　综上所述，三七经超细粉碎处理后，对兔心肌缺血再灌注损伤较常规颗粒有更显著的保护作用，为三七超细粉体进一步开发及临床应用提供了实验依据。

参考文献

［1］ Staat P， Rioufol G， Piot C，et al.Postconditioning the human heart ［J］.Circulation， 2005，112（14）：2143-2148.

［2］ 刘 季，陈 朋，方功德.三七总皂甙对犬心肌的保护作用［J］.中国循环杂志，1998，13（2）：109-110.

［3］ 郭渝成，唐旭东，顾大勇，等.三七总皂苷对心肌缺血再灌注损伤保护作用的实验研究［J］.中国微循环，2004，8(5)：344.

［4］ 顾国嵘，黄培志，葛均波，等.缺血及三七总皂甙预处理对心肌缺血再灌流损伤的保护作用［J］.中华急诊医学杂志，2005，14(4)：307-309.

［5］ Kanstsu S， Panes J， Russell M， et al.Effect of chronic arterialhypertension on constitutive and induced ICAM1 expression in vivo［J］.Hypertension，1997，29(2):683-689.

［6］ 徐叔云，卞如濂，陈 修.药理实验方法学［M］.3版.北京：人民卫生出版社，2005：1042-1053.

［7］ 周晓慧，周晓霞，杨鹤梅.三七总皂甙防治动脉粥样硬化的研究进展［J］.承德医学院学报， 2003，20(4): 350-352.

［8］ 李保军，张宝恒.三七中人参三醇苷抗心律失常作用的研究［J］.药学学报，1988，23（3）：168-173.

［9］ 唐旭东，姜建青，赁常文，等.三七总皂苷对心肌缺血再灌注损伤的影响［J］.中医杂志，2003，44（1）：61-63.