缺血再灌注损伤后大鼠神经功能改变及大脑Homer1蛋白的表达

　　　　作者：姜敏，马正良，顾小萍，张娟，刘成龙

【摘要】 目的：观察大鼠局灶缺血再灌注(I/R)后神经功能的改变及脑内Homer1a、Homer1b/c蛋白的表达变化。方法:雄性SD大鼠120只，随机分为正常组(N组)，假手术组(S组)及I/R组，每组40只，I/R组用大脑中动脉栓塞制作模型;S组仅行手术操作，不行线栓栓塞;N组正常饲养作为空白对照。分别在损伤后6、12、24、48及72 h采用神经损伤严重度评分(NSS)法对3组大鼠神经功能进行评估，取再灌注后0、1 h及上述时间点大鼠额顶叶皮层、海马裂解匀浆行Western blotting，对 Homer1a及Homer1b/c蛋白行免疫印迹分析。结果: NSS显示I/R组大鼠在再灌注后6 h神经功能损伤最为明显(与同组其他时间点比较，P&<0.001)，然后逐渐恢复，72 h时接近术前水平(与N、S组比较，P&<0.05)。Western blotting 结果显示，I/R组神经组织中Homer1a蛋白的表达自伤后0 h起持续至伤后72 h，而正常及假手术组未见该蛋白阳性表达;Homer1b/c在3组均可见持续表达。结论:大鼠I/R损伤后Homer1a蛋白的表达于损伤前后有显著变化而Homer1b/c则无，结合NSS提示Homer1a蛋白可能参与脑I/R引起的神经功能损伤过程。

【关键词】 缺血再灌注; Homer蛋白; 神经病理学评分; 大鼠

　　[Abstract] Objective: To observe the neurological changes and expression of protein Homer1a and Homer1b/c in rat brain with ischemiareperfusion insult. Methods: 120 male SD rats were randomly pided into 3 groups of 40 each: normal group(N)， sham group(S) and ischemiareperfusion group(I/R). The model of I/R was established by middle carotis arterial occlusion(MCAO) in I/R group. Operation procedures of the S group was the same as the I/R except for not conducting occlusion with nylon lines. Rats in N group was bred normally without any treatment. According to the observation time point， the scores of neurological deficits were evaluated at 6，12，24，48，72 h after operation respectively among the 3 groups. Then the levels of Homer1a protein expression in the frontal cortex，parietal lobe and hippocampus were measured by Western blotting at 0，1，6， 12，24，48 and 72 h after operation. Results: The scores of NSS showed that the neurological impairment in I/R group(12.56±1.24) was most serious at 6 h after I/R compared with other time points in the same group( P&<0.001)， and then decreased gradually to the lowest(2.44±0.72， compared with group N and S， P&<0.05) at 72 h after reperfusion. Homer1a was positive in I/R group from 0 h to 72 h after injury but no Homer1a was observed in normal group and sham group by Western blotting analysis. Homer1b/c were persistently expressed in the normal， sham and I/R groups. Conclusion: There is a significant change in Homer1a expression before and after I/R insult， but no significant changes in Homer1b/c. These changes may be correlated with the neurological impairment.

　　[Key words] ischemiareperfusion; Homer protein; neurological severity scores; rats

　　围手术期外科操作、脑梗死、失血性休克等常可发生局部的缺血再灌注(ischemiareperfusion，I/R)损伤。脑是富含磷脂的器官，对缺血缺氧十分敏感，I/R损伤将会严重影响患者生存质量。因此积极探索脑I/R损伤的分子机制有着重要的医学和社会价值。

　　近年的研究发现，一种突触后密度蛋白Homer1a可负向调节神经细胞的过度兴奋，可能具有神经保护作用[1-3]。Homer1a是Homer家族中第一个被确认的蛋白[4]，可由神经活动诱导而快速、短暂地增加表达，其表达增加有重要的生理意义[5-6]。Homer1a的功能主要通过与组成型表达的剪切变体Homer1b/c竞争与许多受体的结合而产生，Homer1a及Homer1b/c是Homer蛋白家族中的主要成员。目前比较热门的I/R后神经损伤机制认为Homer蛋白是关键分子，其参与兴奋性氨基酸谷氨酸及其受体的兴奋通路，参与如神经病理性疼痛[7]、脑损伤[8]等神经病理生理过程，但在脑局灶IR损伤后Homer1蛋白表达的变化情况如何尚未见报道。

　　本实验采用大脑中动脉栓塞(middle carotis arterial occlusion， MCAO)法制作局灶脑I/R模型，在稳定的I/R模型基础上通过免疫印迹技术观察I/R损伤对大鼠神经功能及Homer1a、Homer1b/c蛋白表达的影响，探讨二者参与该损伤过程的关键蛋白亚型，为探索该疾病的病理生理机制及开发新的神经保护剂提供思路。

　　1 资料与方法

　　1.1 仪器与试剂

　　Homer蛋白多克隆抗体购自SantaCruz公司，Western blotting相关试剂盒包括不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDSPAGE)低分子质量标准蛋白及BCIP/NBT显色盒购自碧云天生物技术研究所。

　　1.2 实验对象及分组

　　动物由徐州医学院动物实验中心提供，健康雄性SD大鼠120只，体重250～280 g，在20 ℃、50%湿度环境中饲养，自由饮水摄食，昼夜各12 h。随机分为正常组(N组)、假手术组(S组)及I/R组各40只，I/R组出现对侧horner征及肢体活动障碍的大鼠方可进入下一步实验。

　　1.3 动物模型制作

　　术前12 h大鼠禁食不禁水，术中用烤箱保持动物体温。腹腔注射水合氯醛350 mg·kg-1麻醉后，将大鼠置于操作台上仰卧位固定， 颈部局部剪毛，碘伏消毒，颈正中切口，游离并结扎右侧颈总动脉(CCA)、颈外动脉(ECA)，游离颈内动脉(ICA)主干一段，穿活线备用，无创微血管夹夹闭颈内动脉。在靠近ECA、ICA分叉处剪开CCA一个小口，将预先浸泡到肝素生理盐水中的插线栓子插入，松开微血管夹，缓缓通过游离颈内动脉入颅，适度调节颈总动脉悬线的角度以利于线栓插入，插线有轻微阻力感且深度约为(1.8±0.5)cm时，固定线栓并缝合皮肤，体外留少许栓线，造成大脑中动脉供血范围的局灶性脑缺血状态。插线留置于血管内2 h后拔出，完成I/R模型的制作[9]。

　　1.4 行为学

　　本实验借鉴Li等[10]的神经损伤严重度评分(neurological severity scores， NSS)方法，结合改良NSS[11]评估大鼠神经功能缺损。NSS包括运动、感觉、平衡和反射，为0～18分，0分为正常，分值越高表示损伤越重。每组各16只大鼠术前1 d测定基础值1次，术后连续测6、12、24、48和72 h动物行为学改变，测试前均适应观测环境30 min。每只大鼠每次测试3次，取其平均值为NSS结果。

　　1.5 Westernblotting

　　各组大鼠分别在术后0、1、6、12、24、48和72 h取缺血侧海马及覆盖在海马上方脑额顶叶皮层匀浆，12 000×g离心10 min后取上清，BCA法测定蛋白浓度，平衡各上样样本总蛋白一致。行SDSPAGE凝胶电泳，最后采用BCIP/NBT显色剂显示各组Homer蛋白。每组各21只大鼠，7个时间点每点取3只。

　　1.6 统计学处理

　　应用SPSS 16.0统计软件进行分析，计量资料以x±s表示。组间比较采用重复测量数据的方差分析，结果有差异后采用LSD法作进一步分析，组内比较采用单因素方差分析。P&<0.05视为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 I/R对大鼠神经功能的影响

　　剔除手术过程中评估前死亡的大鼠，实际参与本实验大鼠S组为17只，I/R组为18只。I/R组大鼠麻醉清醒后出现神经功能缺失，表现为缺血侧眼裂变小、上眼睑无力，对侧肢体活动障碍，尤以前肢为重。提鼠尾可见其左前肢内收紧贴胸壁，左侧肢体肌力下降，行走时偏向左侧或向左侧旋转，重者向左侧倾倒。本实验成功的I/R模型多在动物苏醒后出现向偏瘫侧旋转的行为学改变。I/R组NSS在再灌注后6 h达到峰值(12.56±1.24)，到72 h时基本恢复(2.44±0.72)，见图1。在术前筛选所有大鼠均无运动及平衡障碍，术后N组及S组NSS评分分值虽不为0，但远远低于I/R组，与I/R组比较P&<0.05。

　　2.2 I/R损伤对大鼠皮层及海马Homer1a、Homer1b/c表达的影响

　　见图2。模型制作及取脑过程中N组有3只、S组有2只、I/R组有1只大鼠因操作失败而被剔出实验。

　　图2显示，上面的条带为分子质量较大的Homer1b/c，约43 000;下面的条带为分子质量约29 000的Homer1a。各组大鼠额顶叶皮层及海马组织内可见Homer1b/c蛋白阳性持续，而Homer1a只在脑损伤后开始出现并持续至伤后72 h，N组及S组均未见阳性表达，即所谓的诱导表达;所以为了方便观察比较，我们将所有时间点Homer1蛋白的表达放在了1张图上。另外我们也可以看出，即使是有损伤发生脑内Homer1a的表达量也是远远低于Homer1b/c的。

　　3 讨 论

　　脑I/R损伤是一种常见的临床病理生理过程，严重影响患者生存质量，但具体的发生机制仍不明确。

　　本实验中I/R组的大鼠麻醉清醒后表现出同侧Horner征及对侧明显的神经运动功能障碍，在可评估时间内6 h时损害最为严重(6 h以前大鼠尚未从麻醉中完全清醒，对外界刺激反应较差，无法进行运动、平衡能力的评估，6 h是经过预实验摸索选定的)，表现为大鼠运动减少、平衡能力极差，对外界刺激反应迟钝。再灌注24 h后NSS分值明显降低，主要体现在大鼠缺血对侧的肢体肌力及觅食反射的恢复方面，再灌注48及72 h后，大鼠除了左前肢运动能力稍逊于N组及S组外，其他功能已经接近术前水平。至于S组与N组间的统计差异，我们认为是由于麻醉及手术操作产生的影响，它们分别与I/R组比较，差异仍具有统计学意义，证明NSS较好地反映了I/R损伤对动物神经功能的影响，模型的建立是成功而且稳定的。遗憾的是由于麻醉清醒时间的因素，我们未能评估到损伤后6 h以内神经功能的改变，无法确定损伤开始及最严重功能障碍出现的时间。

　　因为行为学评估受到麻醉因素的限制，结合我们Western blotting的结果来看，损伤6 h内Homer1a蛋白的表达已经开始了，所以不能排除I/R造成的神经损伤在6 h之内更为严重。随着时间的延长，NSS评分显示动物神经功能逐渐恢复，Homer1a蛋白的表达也减少。研究结果显示，在无药物干预下I/R损伤明显影响到Homer1a蛋白的表达，该蛋白在N组和S组大鼠脑内表达几乎检测不到，I/R损伤后表达量瞬间升高并延续一定时间，提示Homer1a蛋白对脑缺血性损伤后引起的神经细胞异常电位活动反应灵敏，可能参与大脑局灶I/R神经细胞损伤过程。而Homer1b/c呈持续性稳定表达且表达水平明显高于Homer1a可能说明该蛋白的主要作用在细胞构架组成上。不足之处在于实验条件及经费所囿，未能取大鼠脑内多个功能核团分别行免疫分析法判断该蛋白的分布，无法判断该蛋白与某些神经功能的关联性。

　　Homer蛋白自1997年Brakeman等发现以来，在许多组织中均有发现，但在中枢神经系统中表达显著。哺乳动物中有3种基因已经得到确认，Homer1、2、3，据其剪切位点不同又分为Homer1ah、Homer2ad、Homer3等10种亚型，其中Homer1是Homer蛋白家族的主要成员。对Homer1a和Homer1b/c的研究较多，Homer1b/c为组成型表达，而Homer1a是诱导型表达，表明Homer1基因的剪切、转录和翻译受神经元突触活化调节。Homer蛋白根据其C末端是否含有CoiledCoil(CC)二级结构分为长型和短型，长Homer蛋白如Homer1b/c在突触后神经元谷氨酸受体信号传导中成簇排列，通过CC区域相互作用和亮氨酸拉链结构形成二聚体或四聚体结构，在此基础上可进一步多聚化，从而以多聚体形式将谷氨酸及其受体包括相关信号传递因子如钙通道受体，IP3R等锚定在靶细胞膜上，形成mGluRHomerIP3R复合体完成兴奋性信号传导[11]。

　　短Homer如Homer1a同其他家族蛋白一样，N末端含有高度保守序列EVH1结构域，可结合兴奋性氨基酸受体传递细胞信号。但其C末端缺乏CC结构域不能形成多聚体，因此可与长Homer蛋白竞争，动态解耦mGluRHomerIP3R复合物，延缓IP3R分子的激活，减少或延迟胞内Ca2+的进一步释放，减轻神经细胞的损伤，而被认为具有神经保护作用[12]。但该蛋白mRNA长约6.5 kDa，决定其基因转录高效但短暂。我们的研究也显示Homer1a在72 h后表达已经接近N、S组水平，证明该蛋白的表达是短暂且不稳定的。

　　综上所述，我们推测Homer1a在I/R损伤后表达增加，是参与竞争性拮抗Homer1b/c蛋白桥联的mGluRHomerIP3R/Ca2+途径，随时间进展该蛋白消耗增多，而又缺乏新的刺激促使该蛋白长时间稳定表达，最终只持续到再灌注后72 h。这个推测又引起我们思考：I/R损伤引起Homer1a蛋白表达的变化，该蛋白在损伤过程中是否如本文所引文献中所言具有神经保护作用?Homer1a保护作用的具体机制又是什么?I/R后该蛋白表达控制在什么水平对机体的保护作用最合适?如果通过药物或是其他刺激手段调节Homer1a蛋白的表达是否可以减轻神经细胞损伤程度呢?这些问题在我们的实验中尚未找到答案，需要进一步的动物实验来探索，从而为临床I/R损伤患者的治疗带来新的思路。

参考文献

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