氟西汀调控胎鼠神经干细胞增殖中Notch1通路基因表达的改变

　　　　 作者：隋毓秀，张志珺，郭怡菁，孙奕

【摘要】 目的：探讨Notch1信号系统与氟西汀促进神经干细胞(NSCs)增殖的关系。方法：不同浓度的氟西汀干预NSCs，获取最适作用浓度。分别予Notch1信号通路抑制剂DAPT和氟西汀干预NSCs后，采用MTT检测NSCs的增殖，real timePCR法检测Notch1信号各因子的基因表达。结果：(1) 不同浓度的氟西汀干预细胞48 h后，10、15和20 μmol·L-1组NSCs的活性高于0 μmol·L-1组，差异有统计学意义(P&<0.01);(2) 与对照组相比，氟西汀组的细胞活性增高，DAPT组的活性降低，差异均有统计学意义(P&<0.001)。与氟西汀干预组相比，氟西汀加DAPT组细胞活性降低，差异有统计学意义(P&<0.001);(3) 与对照组相比，DAPT组Hes1mRNA 和Hes5 mRNA表达显著降低(P&<0.001)，氟西汀组Notch1 mRNA、Hes1 mRNA和Hes5 mRNA表达显著增高(P&<0.001或P&<0.01);与氟西汀干预组相比，氟西汀加DAPT组的Notch1 mRNA、Hes1 mRNA和Hes5 mRNA表达均显著降低(P&<0.001)。结论： 氟西汀可能通过调控Notch1信号的传导促进NSCs的增殖。

【关键词】 神经干细胞; 氟西汀; Notch1信号系统; 大鼠

　　[Abstract] Objective： To investigate whether the effect of fluoxetine on cell proliferation involves Notch1 signaling in cultured neural stem cells(NSCs). Methods： MTT assay was used to evaluate cell viability. The expression of Notch1 signaling components(including Notch1 mRNA， Hes1 mRNA and Hes5 mRNA) was detected by real time PCR. Results： (1) When the cells were treated with the 10， 15 and 20 μmol·L-1 fluoxetine for 48 h， the cell viabilities in cellconditioned media were increased more significantly than that of the 0 μmol·L-1 group(P&<0.01). (2) MTT assay showed the presence of fluoxetine strongly enhanced the cell proliferation(P&<0.001) compared with the control group， while DAPT decreased the cell proliferation(P&<0.001). When fluoxetine was used in combination with DAPT， the cell proliferation was declined(P&<0.001) compared with fluoxetine group. (3) Inactivation of Notch signaling with DAPT led to a rapid reduction in the expression of Hes1 mRNA and Hes5 mRNA(P&<0.001). After the treatment of fluoxetine for 48 h， the expression of Notch1 mRNA，Hes1 mRNA and Hes5 mRNA increased significantly(P&<0.001 or P&<0.01). When NSCs were exposed to fluoxetineconditioned medium with DAPT， real time PCR analysis revealed that the expression of Notch1 mRNA， Hes1 mRNA and Hes5 mRNA was decreased relative to fluoxetineconditioned medium without DAPT(P&<0.001 in all case). Conclusion： Notch1 signaling might play a major role in the proliferation of NSCs promoted by fluoxetine.

　　[Key words] neural stem cells; fluoxetine; notch1 signaling; rats

　　抑郁症是最常见的精神障碍之一，其因高死亡率、高致残率而成为21世纪最重要的引起人类残疾的疾病。有关抑郁症的发病机理，目前尚无定论，近年来大量学者关注于神经重塑障碍假说，并在临床和动物学研究中获得许多支持，认为抑郁症的发生发展伴随着海马神经重塑功能的障碍，而抗抑郁药物选择性5羟色胺再摄取抑制剂(selective serotonin reuptake inhibitors， SSRIs)氟西汀的起效与其逆转神经再生有关[1]。但神经细胞再生作为抑郁症及抗抑郁药的最终作用靶点，其中涉及的信号传导通路有哪些，尚不明了。Notch信号系统与中枢神经系统的发育有关，主要作用是神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的增殖、促神经胶质细胞的分化和学习记忆功能[2]。近年的研究发现，Notch信号通路在成年期动物海马区持续表达，且发挥促进神经重塑的作用。癫痫、脑缺血等疾病状态下，Notch信号系统通过调节自身的功能状态，调节NSCs的增殖、神经细胞的轴突和树突的生长，对成年期中枢神经系统的再生有重要作用[3]。

　　鉴于体外培养具有环境单一、条件易于调控、可避免体内多种因素影响等优点，本研究以体外大鼠胚胎NSCs为模型，采用经典SSRI类药物氟西汀对NSCs进行干预，以γ泌肽酶抑制剂N[N(3， 5difluorophenacetyl) lalanyl]Sphenylglycine tbutyl ester(DAPT)阻断Notch1信号通路[4]，探讨氟西汀对 Notch1信号系统促NSCs增殖的影响，为进一步研究SSRI类药物及抑郁症的病理机制提供实验基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　孕 14.5 d的SpragueDawley大鼠，东南大学医学院动物中心提供;CFM500 E倒置荧光显微镜，Nikon公司;氟西汀，Sigma公司;DMEM/F12培养基、B27添加剂、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、表皮生长因子(EGF)，GIBCO公司;兔抗大鼠巢蛋白(nestin)抗体、小鼠抗大鼠BrdU抗体，Chemicon公司;羊抗小FITC荧光二抗，武汉博士德公司;DAPT，Sigma公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 NSCs原代培养 选取14.5 d胎鼠，分离海马(n=12)，有限稀释法与单克隆培养NSC，培养基成分为DMEM/F12、B27添加剂20 ml·L-1、bFGF 10 g·L-1、EGF 20 g·L-1。待细胞生长成为细胞团时，机械吹打进行传代，每2～3 d传代1次。

　　1.2.2 NSC的鉴定 将1 g·L-1多聚赖氨酸包被盖玻片置于6孔板中，生长良好的单克隆接种于此，2 h和48 h后取出盖玻片，用4%多聚甲醛室温固定， 30 min后进行nestin和BrdU免疫荧光鉴定，兔抗大鼠 nestin (1∶400稀释)，羊抗兔TRITC荧光标记(1∶50稀释);小鼠抗大鼠BrdU(1∶200稀释)，羊抗小鼠FITC荧光标记(1∶50稀释)。BrdU荧光染色前经10 μmol·L-1终浓度5 μmol·L-1 BrdU孵育48 h。

　　1.2.3 四甲基偶氮唑盐(MTT)检测氟西汀对NSCs增殖的影响 第4代神经球分散为单细胞后，以2×104 ml-1密度悬浮于含NSC培养基的96孔板中，20 μl·孔-1，分别给予不同浓度(0、1、5、10、15、20、25、30、40、45、50 μmol·L-1)的氟西汀干预细胞，培养48 h后加入MTT工作液20 μl，混匀，37 ℃孵育4 h，每孔加入100 μl二甲基亚砜(DMSO)，振荡10 min，使充分溶解。在酶标仪上570 nm波长处测量各孔吸光度值，每个浓度设8个复孔，实验重复3次，计算其平均值。同时设立NSC(2×104 ml-1密度) 组和含NSC(2×104 ml-1密度) 的DMSO对照组，过程同前。以上可获取最适氟西汀作用浓度。

　　1.2.4 DAPT和氟西汀对神经干细胞增殖的影响 DAPT溶解于10%的DMSO溶液中备用。第4代神经球分散为单细胞后，以2×104ml-1密度悬浮于含NSCs培养基的96孔板中， 100 μl·孔-1，分别给予氟西汀(最适浓度)、DAPT(终浓度10 μmol·L-1)、氟西汀加DAPT干预，同时设立含NSC(2×104ml-1密度) 的DMSO对照组。DMSO的浓度不超过0.1%，以保证对氟西汀和细胞增殖均无影响。培养48 h后加入MTT工作液20 μl，混匀，37 ℃孵育4 h，每孔加入100 μl DMSO，振荡10 min使充分溶解。在酶标仪上570 nm波长处测量各孔吸光度值，每个浓度设8个复孔，实验重复3次，计算其平均值。

　　1.2.5 Realtime PCR法检测Notch通路基因的表达 给予6孔培养板内传第4代细胞不同浓度的氟西汀干预24 h后，用Triziol法提取总RNA，然后用逆转录酶将mRNA逆转录为cDNA。构建聚合酶体系(见表1)。Taq酶(Promega)催化。热循环：95 ℃预热5 min，35个循环(95 ℃ 10 s;57 ℃ 15 s，72 ℃ 20 s，85 ℃ 5 s)。各样品目的基因和管家基因分别进行SYBR荧光实时定量PCR反应，检测Notch通路相关因子基因表达水平，各实验组均取同样条件下培养的3份标本进行检测，取其平均值，结果表示为由梯度稀释DNA标准曲线得到样品目的基因校正后的相对含量(目的基因与内参比值)±标准差。表1 Notch通路各因子引物序列

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以±s表示，采用SPSS 10.0统计软件进行单因素方差分析，各组均数的比较采用Tamhanes法(方差不齐性)或Bonferroni法(方差齐性)。

　　2 结 果

　　2.1 NSC形态学观察和鉴定

　　Nestin是NSC的标记蛋白，BrdU用来标记具有增殖活性的细胞。镜下可见NSC呈悬浮球状生长(图1);免疫荧光染色可见绿色Brdu和红色nestin荧光双标的神经球(图2)。说明所培养的细胞具有增殖能力。

　　2.2 氟西汀对NSCs增殖的影响

　　表2显示不同浓度氟西汀干预48 h后MTT法检测的吸光度值，间接反映其对NSCs增殖的影响。结果提示，不同浓度的氟西汀干预细胞48 h后，10 、15和20 μmol·L-1组NSCs的活性高于0 μmol·L-1组，差异有统计学意义(P&<0.01)。氟西汀浓度≥40 μmol·L-1，细胞的活性则降低，差异均有统计学意义(P&<0.01或P&<0.05)。由此获取氟西汀作用半数有效浓度为15 μmol·L-1。

　　2.3 DAPT和氟西汀对神经干细胞增殖的影响

　　图3显示对照组、氟西汀(最适浓度15 μmol·L-1)、DAPT(终浓度10 μmol·L-1)和氟西汀加DAPT干预后MTT法检测的吸光度值，间接反映其对NSCs增殖的影响。结果提示，与对照组(为0.39±0.01)相比，氟西汀组的细胞活性增高(为0.44±0.02)，DAPT组的活性降低(为0.25±0.02)，差异均有统计学意义

　　(P&<0.001)。与氟西汀干预组相比，氟西汀加DAPT组细胞活性降低(为0.38±0.01)，差异有统计学意义(P&<0.001)。表2 不同浓度氟西汀对NSCs的影响(±s)

　　2.4 Realtime PCR法检测Notch通路相关因子基因的表达

　　图4显示对照组、氟西汀(最适浓度15 μmol·L-1)、DAPT(终浓度10 μmol·L-1)和氟西汀加DAPT干预后Notch1信号通路相关因子基因的表达。结果提示，与对照组(Notch1 mRNA为0.96±0.17，Hes1 mRNA为0.80±0.14，Hes5 mRNA为0.43±0.02)相比，DAPT组Hes1 mRNA (0.22±0.05)和Hes5 mRNA(0.17±0.02)表达显著降低(P&<0.001)，DAPT组Notch1(0.80±0.11)无显著差异(P&>0.05);与对照组相比，氟西汀组Notch1 mRNA(1.52±0.20)、Hes1 mRNA(1.06±0.08)和Hes5 mRNA(0.76±0.09)表达显著增高(P&<0.001 or P&<0.01);与氟西汀干预组相比，氟西汀加DAPT组的Notch1 mRNA(1.02±0.19)、Hes1 mRNA(0.26±0.03)和Hes5 mRNA(0.16±0.03)表达均显著降低(P&<0.001)。

　　3 讨 论

　　大量研究已证实，抑郁症者存在海马神经再生的障碍，SSRI类抗抑郁药物可以逆转其对海马神经增生的抑制。我们前期的动物在体实验表明，氟西汀干预后，大鼠海马齿状回NSCs增殖显著增加，同时Notch1信号通路相关因子(Notch1、Jagged1、Hes1、Hes5)蛋白及基因表达水平显著升高，提示Notch1信号系统可能在氟西汀调节NSCs增殖过程中发挥作用[5]。由于Notch信号系统在体内广泛分布，调节多系统的细胞再生，在体使用拮抗剂或激动剂均可能对实验结果造成干扰[6]，因此，我们利用体外培养环境单一、条件易控的优势，以体外大鼠胚胎海马齿状回NSCs为模型，采用γ泌肽酶抑制剂DAPT阻断Notch1信号通路，观察氟西汀促进神经干细胞增殖过程中Notch信号通路可能的作用。

　　本研究结果显示，氟西汀浓度≥40 μmol·L-1时NSCs的活性明显降低，产生细胞毒性作用。所以，在探讨氟西汀对NSCs增殖的影响时，我们使用浓度&<

　　20 μmol·L-1的氟西汀(与其他研究所采用的氟西汀药物浓度较相近，且在该浓度范围内)，未引起NSCs形态学变化[7-9] 。10、15和20 μmol·L-1氟西汀干预48 h后，NSCs的活性显著增加，进一步印证其促进NSCs增殖的作用。Malberg等[10]发现，氟西汀可以有促进海马齿状回NSCs增殖的作用;Encinas等[11]通过成年大鼠大脑离体神经培养得出结论，氟西汀仅作用于成体NSCs，发挥促进增殖的功效，而与其分化无关。而长达4周的在体研究也证实，氟西汀处理增加BrdU阳性细胞比例是通过促进细胞增殖实现的，对细胞分化没有任何影响[12]。所以本实验仅考察NSCs的增殖。

　　Notch基因于1919年被发现，其因部分丧失功能的突变体将在果蝇翅膀的边缘造成缺口(Notch)而得名。Notch信号在中枢神经系统的发育过程中起到关键作用，Notch1对于神经前体细胞的定向分化及其维持是必需的[2]。近年的研究发现，Notch1及其相关蛋白在成年动物脑内海马区持续表达 [13]。Notch1的过度表达促进神经前体细胞增殖，提示其对成年期中枢神经系统的再生有重要作用[14]。

　　本研究结果显示，采用DAPT干预后，Notch1信号通路的下游因子Hes1 mRNA、Hes5 mRNA表达下降，证实DAPT发挥了其阻断信号传导的作用。Notch1是Notch通路细胞膜表面的受体，DAPT作为γ泌肽酶抑制剂仅在胞内发挥抑制其裂解的作用，不影响细胞表面Notch1受体的表达，所以Notch1基因水平虽有下降的趋势但并不显著[15]。MTT检测发现，DAPT干预后信号传导阻断，NSCs活性随之降低，提示Notch1信号系统对NSCs的促增殖作用受到抑制。此前，Nakamura等[16]和Hitoshi等[17]在离体的状况下利用γ泌肽酶抑制剂阻断Notch1信号通路，发现NSCs发生减少。这些均说明Notch1信号系统在NSCs增殖过程中发挥重要作用。采用氟西汀干预后，NSCs活性增加的同时，Notch1信号通路的各因子包括Notch1 mRNA、Hes1 mRNA、Hes5 mRNA的表达均显著增加，说明Notch通路的功能被激活;当采用氟西汀和DAPT联合干预，原先氟西汀的促NSCs增殖作用被逆转，同时Notch1信号通路的各因子包括Notch1 mRNA、Hes1 mRNA、Hes5 mRNA的表达水平较氟西汀组均显著下降。以上结果提示，氟西汀作用下Notch1信号通路的表达与NSCs的增殖呈并行关系，NSCs增殖增加，信号通路基因表达上升，Notch通路功能激活;阻断Notch1通路后，NSCs增殖减少。Hes1、Hes5作为Notch信号途径的靶基因，较之其它因子(如HES3)，与维持NSCs在未分化状态的联系更为紧密.并且发现在哺乳动物大脑发育中HES5可以作为特定标记物来区分NSCs与其它祖细胞[18]。因而，Hes1和Hes5的表达增加，与促进NSCs增殖有密切关系。这些说明氟西汀对 Notch1信号系统促NSCs增殖的作用有影响，氟西汀可能通过调控Notch1信号的传导促进NSCs的增殖，Notch1通路有可能是与氟西汀作用相关的下游信号分子靶点。

　　本实验再次证实了Notch1信号系统在NSCs增殖中的重要地位和氟西汀对NSCs的促进增殖作用，并且发现当采用DAPT阻断Notch1信号通路的表达时，氟西汀的促增殖作用减弱，提示氟西汀可能通过调控Notch1信号的传导促进NSCs的增殖，Notch1通路有可能是与氟西汀作用相关的下游信号分子靶点。这些为进一步的在体研究及探讨抑郁症的发生机制提供了新的思路。

参考文献

　[1] WARNERSCHMIDT J L， DUMAN R S. Hippocampal neurogenesis: opposing effects of stress and antidepressant treatment[J]. Hippocampus，2006，16:239249.

　　[2] GAIANO N， NYE J S， FISHELL G. Radial glial identity is promoted by Notch1 signaling in the murine forebrain[J]. Neuron，2000，26:395404.

　　[3] ARUMUGAM T V， CHAN S L， JO D G， et al. Gamma secretasemediated Notch signaling worsens brain damage and functional outcome in ischemic stroke[J]. Nat Med，2006，12:621623.

　　[4] NELSON B R， HARTMAN B H， GEORGI S A， et al. Transient inactivation of Notch signaling synchronizes differentiation of neural progenitor cells[J]. Dev Biol，2007，304：479498.

　　[5] SUI Y， ZHANG Z， GUO Y， et al. The function of Notch1 signaling was increased in parallel with neurogenesis in rat hippocampus after chronic fluoxetine administration[J]. Biol Pharm Bull，2009，32:17761782.

　　[6] BREUIG J J， SILBEREIS J， VACCARINO F M， et al. Notch regulates cell fate and dendrite morphology of newborn neurons in the postnatal dentate gyrus[J].Proc Natl Acad Sci USA，2007，104:2055820563.

　　[7] SHIHHWA C， SHIHJEN C， CHIHSIEN P， et al. Fluoxetine upregulates expression of cellular FLICEinhibitory protein and inhibits LPSinduced apoptosis in hippocampusderived neural stem cell[J]. Biochem Biophys Res Commun，2006，343:391400.

　　[8] ZUSSO M， DEBETTO P， GUIDOLIN D， et al. Cerebellar granular cell cultures as an in vitro model for antidepressant druginduced neurogenesis[J]. Crit Rev Neurobiol，2004，16:5965.

　　[9] 张晓斌，张志珺，谢春明，等.氟西汀对抑郁模型大鼠海马区胶质细胞源性神经营养因子 mRNA表达的影响[J].东南大学学报：医学版，2009，28(3):228232.

　　[10] MALBERG J E. Implications of adult hippocampal neurogenesis in antidepressant action[J]. J Psychi and Neurosci，2004，29:196205.

　　[11] ENCINAS J M， VAAHTOKARI A， ENIKOLOPOV G. Fluoxetine targets early progenitor cells in the adult brain[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2006，103:82338238.

　　[12] MANEV H， UZ T， SMALHEISER N R， et al. Antidepressants alter cell proliferation in the adult brain in vivo and in neural cultures in vitro[J]. Eur J Pharmacol，2001，411(5):6770.

　　[13] PRESENTE A， BOYLES R S， SERWAY C N， et al. Notch is required for longterm memory in Drosophila[J]. Proc Natl Acad Sci USA，2004，101:17641768.

　　[14] WANG Y， CHAN S L， MIELE L， et al. Involvement of Notch signaling in hippocampal synaptic plasticity[J]. Pro Natl Acad Sci USA，2004， 101:94589462.

　　[15] HATAKEYAMA J， BESSHO Y， KATOH K， et al. Hes genes regulate size， shape and histogenesis of the nervous system by control of the timing of neural stem cell differentiation[J]. Development，2004，131:55395550.

　　[16] NAKAMURA Y， SAKAKIBARA S， MIYATA T， et al. The bHLH gene hes1 as a repressor of the neuronal commitment of CNS stem cells[J]. J Neurosci，2000，20:283293.

　　[17] HITOSHI S， ALEXSON T，TROPEPE V， et al. Notch pathway molecules are essential for the maintenance， but not the generation， of mammalian neural stem cells[J]. Genes Dev，2002，16:846858.

　　[18] BASAK O， TAYLOR V. Identification of selfreplicating multipotent progenitors in the embryonic nervous system by high Notch activity and Hes5 expression[J]. Eur J Neurosei，2007，25(4):l0061022.