螺内酯预处理对兔非梗死区冠脉内皮eNOS表达及心梗后血流动力学的影响

　　　　 作者：郭再萍，石国平，郭江宏，徐琴，沈建宏，马根山

【摘要】 目的：探讨螺内酯预处理对兔心肌梗死(心梗)早期非梗死区冠脉内皮内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达及血流动力学的影响。方法：将24只雄性新西兰大耳白兔随机分为A、B、C 3组，A、B组予饲喂高脂饲料，C组饲喂普通饲料;A组予螺内酯(20 mg·kg-1·d-1)口服4周，结扎前降支复制急性心梗模型。测定术前及术后血醛固酮(Aldo)浓度及结扎近心段冠脉内皮eNOS表达情况，测定左室的血流动力学变化并加以比较。结果：A、B组eNOS表达均弱于C组，而A组高于B组(均P&<0.05);A、B两组术后血Aldo浓度明显高于C组(P&<0.05)，A、B组间比较差异无显著性(P&>0.05);A、B两组左室平均收缩压(MSP)、平均舒张压(MDP)、平均动脉压(MAP)及左室等容收缩功能(+dp/dt max)明显高于C组(P&<0.05)，而A组左室MSP、+dp/dt max的变化值又均高于B组(P&<0.05)。结论：螺内酯可使非梗死区冠脉内皮eNOS表达增强;螺内酯可以改善心梗早期的血流动力学状态，具体机制可能与其能协同Aldo的非基因组作用促进非梗死区冠脉扩张有关。

【关键词】 螺内酯; 急性心肌梗死; 内皮型一氧化氮合酶; 非基因组作用; 表达; 兔

　　[Abstract] Objective: To investigate the effect of spironlactone on the expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS) in rabbit coronary artery of noninfarcted area and the hemodynamics in the early period of acute myocardial infraction(AMI). Methods: 24 male rabbits were pided into three groups(A，B，C) randomly.Rabbits in group A and B were both fed with high fat diet for four weeks， and those in group A were fed with spironolactone(20 mg·kg-1·d-1)at the same time.The middle and distal segments of anterior descending branch of all rabbits were ligated to make AMI model. The level of aldosterone(Aldo) and the expression of endothelial nitric oxide synthase(eNOS) in coronary endotheliocyte which was located near the spot of deligation were determined 15 minutes postoperation. The hemodynamic state of left ventricular was measured and compared. Results: The eNOS expression of coronary endotheliocyte in both group A and B was weaker than that in group C，and that in group A was stronger than that in group B(P&<0.05). The level of Aldo in group A and B was much higher than that in group C(P&<0.05)， and there were no significant differences between group A and group B. The levels of mean systolic pressure(MSP)， mean diastolic pressure(MDP)， mean aterial blood pressure(MAP) and isovolumic contraction function(+dp/dt max) of left ventricular in group A and B were much higher than those in group C， and the changes of MSP and +dp/dt max of left ventricular in group A were more significant than those in group B.Conclusion:Spironolactone can enhance the expression of eNOS in coronary endotheliocyte that hasnt been deligated. Spironolactone could improve the hemodynamic state of heart in early period of AMI，and the possible mechanism might be connected with the fact that it can promote coronary dilation in noninfracted area in coordination with the nongenomic function of Aldo.

　　[Key words] spironolactone; acute myocardial infarction; endothelial nitric oxide synthase; nongenomic function; expression; rabbits

　　近年来有研究发现，醛固酮(Aldo)可以由肾上腺外非上皮组织如血管、心脏和脑组织合成，而且这些组织细胞表面也同时存在盐皮质激素受体(mineralocorticoid receptor，MR) [1]，在对慢性心衰患者采用MR阻滞剂有效性评估研究RALES [2]和EPHESUS[3]问世以来，MR拮抗剂已成为治疗慢性心衰的一线药物，其主要机制为抑制胶原纤维沉积、改善心肌重构，但对急性期其所起作用却鲜有研究涉及。近期随着基础研究的深入，Aldo在心肌梗死(心梗)早期即可以通过非基因组作用机制影响预后，这种非基因组作用可以增加心脏的正性肌力作用，增加冠脉灌注[4]，而且还有报道认为螺内酯有强化这一作用的可能[5]，所以对螺内酯在心梗早期所起的作用值得探讨。

　　1 对象与方法

　　1.1 动物及分组

　　体重2.25～2.75 kg的24只新西兰大耳白兔由南通大学实验动物中心提供，按抽签法随机平均分成A、B、C 3组各8只，A、B两组均予高脂、高胆固醇、高糖饲料(按1%胆固醇、5%猪油、10%绵白糖配制，80 g·d-1，不足部分由普通饲料补足)饲喂，C组予普通饲料饲喂。其中A组同时予螺内酯(20 mg·kg-1·d-1)口服预处理4周。

　　1.2 方法

　　1.2.1 建立急性心梗模型 参照有关资料，开胸结扎冠状动脉前降支，复制急性心梗模型。术前常规禁食8～12 h，饮水不限，氯氨酮40 mg·kg-1、氟哌利多1.6 mg·kg-1肌肉注射麻醉动物后沿胸骨左缘打开胸腔、心包，暴露心脏，用60眼科无创缝线结扎冠状动脉左前降支中远端(距心尖1.0 cm)。结扎后观察心电图Ⅱ导联有无ST 段显著抬高(或者出现心率减慢10%以上并伴有R波波幅降低)、左室前壁颜色变白与否，判断造模是否成功，然后清除心包腔积血后逐层关胸。

　　1.2.2 颈动脉插管及血流力学测定 造模术前，在麻醉状态下行颈动脉插管。颈前区剪毛，8%硫化钠脱毛后常规消毒铺巾，切开皮肤及皮下浅筋膜，分离一侧颈外动脉后插入5 F聚乙烯导管至左心室，接BL420E生物信号转导记录观测主动脉根部和左室腔内压力波形，分别测定主动脉根部和左室等容收缩功能

　　+dp/dt max，反映左室收缩/舒张功能的变化情况。判断导管进入左心室的标准是压力曲线振幅突然增大并维持于一个稳定的平台上，且不受呼吸影响。术后30 min再次重复测定以上血流动力学数值。测定内容包括左室平均收缩压(MSP)、平均舒张压(MDP)、平均动脉压(MAP)及左室+dp/dt max、-dp/dt max，并计算各组的变化值(术后值-术前值)，以△MSP、△MDP、△MAP、△+dp/dt max、△-dp/dt max表示。

　　1.2.3 生化指标的检测、实验动物的处死和心脏标本的保存 分别于术前、处死前抽取耳缘静脉血2 ml，用于测定血Aldo浓度(化学发光法)。并计算术后的变化值(术后值/术前值，即△Aldo)。由耳缘静脉注入氯化钾使心室停博于舒张期，迅速开胸切取心脏，用预冷盐水冲洗，去除心房、右室、大血管及心脏外结缔组织，留取左心室(含室间隔)。在结扎点处垂直于长轴将左心室一分为二，心尖侧一半心肌经甲醛固定包埋后行横断面切片(与心脏纵轴垂直)后病理组织学检查并判断心梗是否形成及其程度。近心底部心肌固定后沿横轴(以前降支为中心)切片，HE染色观察各组冠脉硬化的情况，采用免疫组化法测定冠脉内皮内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达情况(按照操作说明书严格规范操作)。

　　1.2.4 试剂 胆固醇结晶由上海亚法生物技术有限公司提供。猪油及绵白糖均从市场上购得。Aldo检测试剂由上海海尔斯公司提供，eNOS抗体及二步法免疫组化试剂盒(PV6001)均购自北京博奥森生物有限公司。

　　1.3 统计学处理

　　所有数据以x±s表达，两组数据比较用t检验，两组以上数据采用SPSS 11.5软件包单因素方差分析方法进行差异显著性检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　A、B组各有1只动物术中死亡。3组动物的平均体重无明显差异。A、B两组动物均见不同程度的内膜增厚，部分见粥样斑块形成。

　　A、B组动物非梗死区冠脉内皮eNOS表达均低于C组，且A组高于B组(P&<0.05)，免疫组化结果见图1;A、B两组处死前的Aldo浓度变化(△Aldo=术后Aldo浓度/术前Aldo浓度)明显高于C组(P&<0.05)，A、B组间比较无明显差异。详见表1。表1 各组eNOS表达及Aldo浓度的比较(±s)

　　A组左室△MSP、△MAP及△+dp/dt max、△-dp/dt max明显高于B、C组(P&<0.05)，而B组的左室△MSP及△+dp/dt max高于C组(P&<0.05)，详见表2。

　　3 讨 论

　　自从RALES、EPHESUS在临床应用取得良好效果表2 各组血流动力学比较后，目前MR拮抗剂已作为严重心衰的一线药物，理论基础主要是认为其有阻断胶原合成、改善重构的作用。近年发现，Aldo还能提高许多血管活性肽的生理反应，其与心梗早期心血管事件危险的关系已引起了高度重视[5]。Funder总结Aldo对心血管系统的影响时认为，其在心血管事件早期，可能通过非基因组途径起到调节血管功能、影响冠状动脉血流的作用[6]。近期的研究表明，Aldo的作用途径分为基因组与非基因组。前者是指传统的激素与细胞表面的受体结合继而影响蛋白质合成的一种调节途径，这一途径作用相对缓慢;而非基因组作用是快速的作用途径，具有作用时间迅速、不被转录和翻译抑制剂阻断并且不被MR阻断剂阻断的特点[7]，其具体机制不详，但普遍认为涉及细胞内第二信使通路的激活。

　　国外的相关研究表明，Aldo的非基因组作用主要表现为增加冠状动脉灌注及心肌收缩力，在心梗早期可以起到部分代偿作用，而部分MR拮抗剂可以促进这一作用，对尚未出现心衰的冠心病患者的冠脉内皮，其在应激状态下有一定的保护作用[8]。我们在实验中观察到，心梗的极早期，在心梗导致的强烈应激条件刺激下，伴随着Aldo水平明显升高，冠脉内皮的eNOS表达有所增强，而且这种现象在Aldo水平没有明显差异的情况下，因为使用螺内酯预处理而得到进一步增强。同时血流动力学测定显示，随着eNOS表达的增强，左室的收缩功能及顺应性均有不同程度的加强。这与Barbato等[9]2002报道的结果一致。至于为何螺内酯会促进eNOS的表达、增加灌注、增强心肌收缩，其机制目前尚不十分清楚，还有待进一步研究。部分研究认为，不同的MR拮抗剂对Aldo非基因组作用有不同的效果，有人认为主要是为MR的分子结构及溶解特性所决定。螺内酯是具有闭合E环的脂溶性的MR阻断剂，与具有开放E环的水溶性的MR阻断剂如坎利酸钾盐(canrenoatepotassium)、RU28318、依普利酮(eplerenone)等不一样，并不能阻断Aldo的某些非基因组作用[10]，甚或有促进作用。但我们的实验结果表明，使用螺内酯预处理，可以在心血管事件早期增加冠脉的灌注、加强心肌正性肌力，对减少心肌缺血面积、改善血供起到积极的作用，应该说对心梗的预后是有积极作用的。但是，同时这一反应也会增加心肌的耗氧量，对已经缺血的心肌也存在很大的影响，所以长期预后如何还有待进一步论证。

　　当然，在实验中受条件限制，我们仅用 eNOS的表达程度作用为螺内酯干预后冠脉扩张的依据，未能进行冠脉直径等形态学测定，同时虽然观察到心脏血流动力学的变化，但没有能进行心肌灌注的检测，所以仅用以上现象推测其可能具有扩张冠脉改善心肌灌注的作用，论据尚不足，还有待在以后的工作中不断完善。

　　总之，使用螺内酯预处理可以对急性心梗早期的心肌灌注起到一定的保护作用。但是由于冠脉事件属于突发事件，临床上早期使用并达到有效药物浓度，在实际操作方面有一定难度。目前临床上MR拮抗剂的推荐使用也仅限于严重心衰，但对尚处于不稳定心绞痛阶段的患者如能早期使用，对于冠脉事件的发生、发展及预后可能会起到积极的作用。

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