p62增加HBsAg+HepG2细胞DRibbles中HBsAg含量的研究

　　　　　　 作者：唐明，薛萌，丁磊，曹萌，王立新

【摘要】 目的：探讨过表达p62能否提高自噬小体中泛素化蛋白的水平。方法：构建pIRES2EGFPHBsAg重组质粒和pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒;脂质体法分HBsAg、UbHBsAg、UbHBsAg+p62组3组转染HepG2细胞，在相同细胞数量和转染效率下，经万珂、雷帕霉素和氯化铵处理转染细胞并提取DRibbles，ELISA法检测其中HBsAg含量。结果：万珂、雷帕霉素和氯化铵处理后，UbHBsAg+p62组HepG2细胞DRibbles中HBsAg显著增高，而且明显高于药物处理的其他两组。结论：当蛋白酶体被抑制时，过表达p62蛋白促进泛素化蛋白(HBsAg)进入自噬小体，阻断自噬降解途径提取的DRibbles能够募集到更多的泛素化蛋白(HBsAg)。

【关键词】 HepG2细胞; DRibbles; p62蛋白; 乙型肝炎表面抗原; 泛素

　　[Abstract] Objective： To approach whether overexpressed p62 could aggregate more ubiquitinated proteins in DRibbles. Methods: Recombinant pIRES2EGFP vector containing the HBsAg or UbHBsAg gene was constructed and transfected into HepG2 cell line respectively and pIRES2EGFPUbHBsAg and pIRES2EGFPp62 were cotransfected into HepG2 cell line. Then the transfected cells were cultured in the medium including velcade， rapamycin and ammonium chloride. After 16 hours， we extracted and lysed DRibbles from the medium and detected HBsAg by ELISA. Results: HBsAg in DRibbles extracted from HepG2 that was cotransfected with pIRES2EGFPUbHBsAg and pIRES2EGFPp62 vectors rapidly increased when the cells were cultured with the drugs， and was much higher than the other groups which had been under the same treating. Conclusion: Overexpression of p62 aggregates more ubiquitinated proteins(HBsAg) in the DRibbles extracted from HepG2 cells as the proteasome pathway is blocked by the drugs.

　　[Key words] HepG2 cell line; DRibbles; p62; hepatitis B surface antigen; ubiquitin

　　细胞自噬DRibbles(DRips in Blebs)是高度保守的细胞生物学行为，其分子机制从酵母细胞到哺乳动物细胞十分相似。在自噬过程中，待降解的胞浆组分及细胞器被包裹在具有双层膜结构自噬小体(autophagy)中，最终与溶酶体融合形成自噬溶酶体，实现胞内物质的降解，从而维持细胞自稳。

　　DRibbles是从肿瘤细胞培养上清提取的具有双层膜结构的自噬小体，其中含有阻断蛋白酶体降解途径而残留的废蛋白(defective ribosome products， DRips)。我们前期实验证明，DRibbles作为肿瘤抗原载体能被DC摄取并通过交叉提呈途径诱导T细胞应答，它是具有潜在价值的肿瘤疫苗载体[1]。

　　近来研究发现，p62作为多种信号传导途径中的支架蛋白，能通过C末端泛素相关结构域(ubiquitinassociated domains， UBA)与泛素化靶蛋白结合，并通过LRS(LC3 recognition sequence， LRS)结构域与LC3结合，然后由LC3介导将泛素化靶蛋白包裹入自噬小体，最后自噬小体与溶酶体融合完成蛋白的降解。因此，p62在两种蛋白降解途径(蛋白酶体降解途径和自噬降解途径)之间发挥着重要的桥梁作用[2]。

　　本研究拟构建乙型肝炎表面抗原(HBsAg)、泛素HBsAg以及p62真核表达质粒，并转染HepG2细胞，提取转染细胞的DRibbles并检测其中HBsAg含量，探讨过表达p62蛋白能否提高自噬小体中泛素化蛋白(HBsAg)的含量，为优化DRibbles肿瘤疫苗提供新的思路。

　　1 材料与方法

　　1.1 质粒和主要试剂

　　pIRES2EGFP质粒由东南大学赵春杰教授赠送;pIRES2EGFPp62质粒和pCMVHBsAg质粒由美国波特兰Franz癌症研究中心HongMing Hu教授赠送;大肠杆菌DH5α为本实验室保存。小鼠泛素表达基因上游引物(Ubf)：5′CTAGC TAGCA TGCAG ATCTT CGTGA AGAC CCT3′(含Nhe Ⅰ酶切位点)，下游引物(Ubr)：5′CCGCT CGAGC GCACC TCTCA GGCGA AGGA3′(含Xho Ⅰ酶切位点); HBsAgf：5′CCGCT CGAGA TGGAG AACAT CGCAT CAGG3′ (含Xho Ⅰ酶切位点)，HBsAgr：5′CCCGA ATTCT TAAAT GTAT

　　A CCCAA AGACA AA3′(含EcoR Ⅰ酶切位点)均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。总RNA提取试剂盒及PCR试剂盒购自Promega公司;反转录试剂盒购自Transgen公司;限制性内切酶、T4连接酶购自MBI公司;质粒抽提试剂盒购自OMEGA公司;RPMI 1640培养液、OptiMEM培养液、LipofectamineTM 2000脂质体、新生牛血清购自Invitrogen公司;HBsAg ELISA诊断试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。HepG2细胞株由本实验室保存。

　　1.2 载体的构建

　　按照图1A示意图构建重组质粒，步骤如下：以pCMVHBsAg作为模板、HBsf和HBsr为上下游引物进行PCR，扩增产物经Xho Ⅰ与EcoR Ⅰ双酶切获得HBsAg编码DNA片段，插入pIRES2EGFP质粒构建pIRES2EGFPHBsAg重组质粒，以PCR法、酶切进行鉴定，阳性克隆进行DNA测序鉴定。获取BALB/c小鼠骨骼肌组织，加3 ml Lysis Buffer后用匀浆器将组织磨碎，按总RNA提取试剂盒说明书提取总RNA，逆转录后以Ubf和Ubr为引物进行PCR扩增小鼠泛素编码基因，纯化PCR产物并经Nhe Ⅰ与Xho Ⅰ双酶切后插入pIRES2EGFPHBsAg质粒构建UbHBsAg融合表达质粒，以PCR法、酶切法进行鉴定，阳性克隆进行DNA测序鉴定。

　　1.3 转染HepG2细胞

　　将处于对数生长期的HepG2细胞转种细胞培养皿，待细胞融合度达到70%时进行细胞转染。设3组、每组2块细胞培养皿：(1) pIRES2EGFPHBsAg质粒单独转染组，(2) pIRES2EGFPUbHBsAg质粒单独转染组，(3) pIRES2EGFPUbHBsAg和pIRES2EGFPp62共转染组。将pIRES2EGFPHBsAg重组质粒(36 μg)、pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒(36 μg)以及pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒(36 μg)和pIRES2EGFPp62重组质粒(18 μg)的混合液分别溶于3个盛有3 ml OptiMEM的离心管中，再分别向3个离心管中加入已经室温孵育5 min的LipofectamineTM 2000脂质体的OptiMEM稀释液3.06 ml，混匀后室温放置20 min。按前述分组分别向每个培养皿中滴加3.33 ml质粒脂质体混合液，混匀后置37 ℃、5%CO2细胞培养箱中，约6 h后换成正常培养基培养24 h。

　　1.4 对HepG2细胞DRibbles中HBsAg含量的检测

　　转染24 h后分别更换2种不同的细胞培养液：正常培养基和含万珂(100 μmol·L-1)、雷帕霉素(10 μmol·L-1)、氯化铵(2 mmol·L-1)培养液，继续培养16 h后收集细胞培养液并提取DRibbles[1]。采用常规ELISA法检测各组DRibbles中HBsAg水平。

　　2 结 果

　　2.1 pIRES2EGFPHBsAg和pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒的构建与鉴定 采用PCR法从pCMVHBsAg质粒上扩增HBsAg基因编码片段，电泳结果显示PCR产物大约为700 bp，与理论值吻合(图1B)。采用RTPCR法从BALB/c小鼠骨骼肌细胞中扩增小鼠泛素蛋白编码基因，电泳结果显示PCR产物大约为250 bp，与理论值吻合(图1C)。

　　采用Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切法鉴定pIRES2EGFPHBsAg重组质粒，电泳结果显示，酶切产物大约为680 bp，与理论值相符(图1D);采用Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ对pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒进行双酶切法鉴定，酶切产物位于910 bp位置，与理论值相符(图1E)。对pIRES2EGFPHBsAg和pIRES2EGFPUbHBsAg质粒分别进行DNA测序，结果显示HBsAg和UbHBsAg编码基因序列正确、读码框架准确(图1F、G)。

　　2.2 细胞转染及其表达的鉴定

　　荧光显微镜观察转染细胞发现，3组转染细胞均可见绿色荧光，转染率大约为15%(图2)，各组间无明显差异。提示转染细胞能表达靶蛋白，相同的转染率为后续组间比较DRibbles中HBsAg含量奠定了基础。

　　A. pIRES2EGFPHBsAg和pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒构建示意图; B. PCR法扩增 HBsAg编码基因，泳道1为DNA Maker，泳道2为PCR产物; C. RTPCR法扩增小鼠泛素蛋白编码基因，泳道1为DNA Maker，泳道2为PCR产物，泳道3为阴性对照; D. 酶切鉴定重组质粒pIRES2EGFPHBsAg，泳道1为DNA Maker，泳道2为Xho Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切，泳道3为质粒对照; E. 酶切鉴定重组质粒pIRES2EGFPUbHBsAg，泳道1为DNA Maker，泳道2为Nhe Ⅰ、EcoR Ⅰ双酶切，泳道3为质粒对照; F. pIRES2EGFPHBsAg重组质粒DNA测序图; G. pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒DNA测序图

　　图1 pIRES2EGFPHBsAg和pIRES2EGFPUbHBsAg重组质粒的构建与鉴定

　　Fig 1 Construction of HBsAg and UbHBsAg expressing vectors A. Schematic representation of the construction of the recombinant HBsAg and UbHBsAg expressing vectors; B. PCR products of HBsAg coding DNA， Lane 1: DNA marker， Lane 2: PCR products; C. RTPCR products of mouse ubiquintin coding DNA， Lane 1: DNA Marker， Lane 2: PCR products， Lane 3: negative control; D. Digestion of vector pIRES2EGFPHBsAg， Lane 1: DNA Marker， Lane 2: products of digested vector pIRES2EGFPHBsAg， Lane 3: vector pIRES2EGFPHBsAg as negative control; E. Digestion of vector pIRES2EGFPUbHBsAg， Lane 1: DNA Marker， Lane 2: products of digested vector pIRES2EGFPHBsAg， Lane 3: vector pIRES2EGFPUbHBsAg as negative control; F. Graph of DNA sequence of HBsAg in recombinant pIRES2EGFPHBsAg vector; G. Graph of DNA sequence of mouse ubiquitin in recombinant pIRES2EGFPUbHBsAg vector图2 荧光显微镜观察转染细胞 ×200

　　Fig 2 Fluorescence images of transfected HepG2 cells ×2002.3 DRibbles中HBsAg含量的检测

　　转染24 h后，3组转染细胞分别更换正常培养液和含万珂(100 μmol·L-1)、雷帕霉素(10 μmol·L-1)以及氯化铵(2 mmol·L-1)的培养液，继续16 h后提取细胞培养上清中的DRibbles，然后采用ELISA法检测HBsAg的含量。结果显示，pIRES2EGFPUbHBsAg单独转染细胞DRibbles中HBsAg含量明显低于pIRES2EGFPHBsAg单独转染细胞DRibbles，万珂、雷帕霉素和氯化铵处理pIRES2EGFPUbHBsAg转染细胞后，DRibbles中HBsAg显著增高。提取UbHBsAg和p62表达质粒共转染HepG2细胞的DRibbles，检测发现：其中HBsAg含量与pIRES2EGFPUbHBsAg转染细胞没有明显差异，但经药物处理后DRibbles中HBsAg的含量显著提高，而且明显高于药物处理的pIRES2EGFPUbHBsAg单独转染组。提示蛋白酶体阻断剂(万珂)能阻断蛋白酶体对泛素化蛋白(HBsAg)的降解，过表达p62能提高自噬小体中泛素化蛋白(UbHBsAg)的含量。见图3。

　　3 讨 论

　　根据细胞内降解时间的长短，可将肿瘤细胞产生的蛋白分为长寿蛋白(longlived proteins)和短寿蛋白(shortlived proteins)两大类[3-8] 。长寿蛋白为细胞内稳定蛋白，其平均半衰期达3 000 min，占总蛋白的70%，其主要通过自噬等途径被降解成游离氨基酸，进入新蛋白的合成循环或以外排体(exosome)形式排出胞外[7-8];短寿蛋白的平均半衰期仅为10 min，约占总蛋白的30%，主要为一些错误编码、错误翻译等产生的DRips以及某些天然短寿的非结构蛋白(shortlived proteins， SLiPs)等[5，9-12]，短寿蛋白的降解主要通过泛素蛋白酶体(ubiquitinproteasome)途径。

　　抗原交叉提呈在肿瘤免疫、肿瘤疫苗设计等方面具有重要作用[13]。我们前期研究证实，提取含有短寿蛋白的肿瘤细胞自噬小体DRibbles作为肿瘤抗原的有效载体，可被DC等APC细胞摄取加工，通过交叉提呈的方式诱导免疫应答[14-15]。但如何更多地募集肿瘤细胞的短寿蛋白或泛素化蛋白以及如何优化DRibbles肿瘤疫苗有待进一步研究。

　　p62作为支架蛋白在多种信号传导途径中发挥作用，包含PB1结构域、锌指结构域(zinc finger， Zinc)、TBS结构域(TRAF6 binding site)、LIR结构域(LC3interacting region， LIR)和泛素相关结构域(ubiquitinassociated domains， UBA)等5个结构域(图4)[16]，近来研究[17-18]发现，p62蛋白通过LIR与UBA分别与自噬小体的跨膜蛋白LC3和泛素化蛋白的泛素结合，被认为在两种蛋白降解途径(蛋白酶体降解途径和自噬降解途径)之间发挥着重要的桥梁作用[2]。p62通过“泛素p62LC3自噬小体途径”参与了泛素化蛋白的细胞自噬降解，肿瘤细胞(作为抗原供者细胞)内“泛素p62LC3自噬小体途径”是否影响自噬小体内泛素化蛋白的含量尚不清楚，能否利用p62分子机制优化DRbbles中肿瘤抗原，以促进交叉提呈也有待深入研究。

　　已知，原发性肝癌与HBV感染密切相关，且尚未发现人肝癌细胞的特异性抗原。以HBsAg为模式抗原，将为探讨“p62能否增加肝癌细胞DRibbles中肿瘤抗原含量”起到示范和标记作用，为此，本实验分别建立表达“HBsAg”和“短寿HBsAg”的肝癌细胞模型。实验结果显示，从表达UbHBsAg转染细胞中提取DRibbles，其中HBsAg含量很低(图3)。万珂是一种蛋白酶体抑制剂，可以抑制蛋白酶体对泛素化蛋白的降解。细胞经万珂作用后蛋白酶体被抑制，泛素化的蛋白不能经蛋白酶体途径降解，变成了“长寿蛋白”而由自噬途径在溶酶体中降解。雷帕霉素是自噬诱导剂，氯化铵可提高溶酶体中的pH值，抑制溶酶体活性，自噬小体无法在溶酶体中降解，转而被排出胞外成为DRibbles。加入万珂、雷帕霉素和氯化铵处理转染细胞，结果显示，pIRES2EGFPUbHBsAg转染细胞DRibbles中HBsAg含量显著增高，提示蛋白酶体抑制剂成功阻断了蛋白酶体对UbHBsAg的降解。

　　随后将pIRES2EGFPUbHBsAg和pIRES2EGFPp62共转染HepG2细胞，提取DRibbles并检测HBsAg发现，与pIRES2EGFPUbHBsAg单独转染细胞一样，DRibbles中HBsAg含量都处于较低水平，提示UbHBsAg主要通过蛋白酶体途径降解，即使过表达图4 p62功能及其结构域示意图

　　Fig 4 Domain organization of p62的p62也不会募集到更多的泛素化蛋白;但经药物处理后，DRibbles中HBsAg显著增高并明显高于pIRES2EGFPUbHBsAg单独转染细胞，提示当泛素化蛋白通过自噬途径降解时，p62蛋白能将更多的UbHBsAg募集到自噬小体中。

　　总之，阻断蛋白酶体途径降解，p62能将更多的短寿蛋白募集到DRibbles中，这为提高DRibbles疫苗中的抗原含量提供了新的技术途径。

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