CD41标记的微小巨核细胞染色在老年贫血诊断中的应用

　　　　　　 作者：邢颖，曲妍，黄佳玲，林树东

【摘要】 目的：探讨CD41标记的微小巨核细胞染色法(SAP染色法)在老年贫血诊断及鉴别诊断中的意义。方法：采用瑞特姬姆萨染色和CD41标记的SAP染色法，分别检测了107例60岁以上老年贫血患者的骨髓涂片中微小巨核细胞的数量和类型。结果：CD41标记的SAP染色法对巨核细胞的检出率明显高于瑞特姬姆萨染色法，两者相比差异有统计学意义(P&<0.01)。不同疾病组比较，微小巨核细胞阳性率MDS组最高，依次为MDS&>ITP&>MA&>ACD&>MM&>IDA&>RA&>AA&>PRCA&>CAA;淋巴样微小巨核细胞MDS组检出率为73.6%，其他组均未检出。结论：CD41标记的SAP染色可以显著提高巨核细胞检出率;且对老年贫血具有一定的鉴别诊断价值。

【关键词】 CD41单抗; 微小巨核细胞; SAP染色; 老年贫血; 鉴别诊断

　　[Abstract] Objective： To assess the significance of the CD41 labelled micromegakaryocyte StreptavidinAlkaline Phosphatase(SAP) staining in the diagnosis and differential diagnosis of senile anemia. Methods: Bone marrow smears from 107 patients with anemia over the age of 60 were detected by WrightGiemsa staining and CD41 labelled SAP staining for the number and types of micromegakaryocytes， respectively. Results: The detection rates of megakaryocyte by the CD41 labelled SAP staining and WrightGiemsa staining had significant difference(P&<0.01). Among the groups， MDS group for the positive rate of micromegakaryocyte ranked the first， followed by ITP&>MA&>ACD&>MM&>IDA&>RA&>AA&>PRCA&>CAA; Detection rate of lymphoid micromegakaryocyte in the MDS group was 73.6%， there were not micromegakaryocytes observed in other groups. Conclusion: CD41 labelled SAP staining obviously increases the detection rate of megakaryocyte， which is valuable for differential diagnosis of senile anemia.

　　[Key words] CD41 McAb; micromegakaryocytes; StreptavidinAlkaline Phosphatase staining; senile anemia; differential diagnosis

　　微小巨核细胞是一类形态异常的小型巨核细胞，见于多种血液病，是骨髓病态造血的特征之一[1]，由于其体积较小，形态多样，常规瑞特姬姆萨(瑞姬氏)染色易与淋巴细胞、幼红细胞等相混淆，漏检率高，从而导致检出率低而限制了在诊断中的价值。我们采用CD41标记的微小巨核细胞染色法(SAP染色法)检测了107例老年贫血患者骨髓涂片，以探讨微小巨核细胞的数量和类型在老年贫血诊断中的价值，现报道如下。

　　1 资料与方法

　　1.1 资料

　　选择2004年1月至2008年12月在我院门诊和住院患者，年龄60岁以上，Hb&<100 g·L-1的患者107例，其中男61例，女46例;骨髓增生异常综合征(MDS)19例，巨幼红细胞贫血(MA)27例，缺铁性贫血(IDA)11例，多发性骨髓瘤(MM)10例，慢性病性贫血(ACD)17例，原发性血小板减少性紫癜(ITP)8例，溶血性贫血(HA)3例，肾性贫血(RA)2例，再生障碍性贫血(AA)5例，纯红再障(PRCA)3例，慢性再生障碍性贫血(CAA)2例。以上病例均已确诊，诊断标准依据文献[2]。

　　CD41标记的微小巨核细胞染色试剂盒购自协和干细胞工程有限公司，瑞姬氏染色液购自珠海贝索(BASO)生物技术有限公司。

　　1.2 方法

　　常规进行骨髓涂片(约2.5 cm×3 cm大小)，然后进行普通的瑞姬氏染色和SAP染色。SAP染色法步骤如下：(1) 将骨髓涂片放入固定液中(甲醇 ∶丙酮=1 ∶1)固定90 s，取出晾干。(2) 在骨髓片上滴加生物素鼠抗人CD41抗体，室温放置40 min，然后用PBS洗涤2次，每次5 min。(3) 滴加碱性磷酸酶链霉卵白素二抗，室温放置30 min，然后用PBS洗涤2次，每次5 min。(4) 显色：取1 mg坚固红加1 ml底物溶液溶解(新鲜现配)，混匀后滴加于骨髓片上，室温放置15 min。镜下观察，待胞膜或胞浆出现明显的红色后用自来水轻轻冲洗，晾干。然后用苏木素复染60 min，自来水冲洗，用0.5%氨水返蓝5 s，自来水冲洗后晾干，镜检。

　　1.3 统计学处理

　　采用SPSS 11.0统计软件进行统计学分析。率的比较采用χ2检验，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 SAP染色法阳性细胞形态

　　显微镜下观察细胞核呈蓝色，胞膜或胞浆呈红色标记的为阳性细胞;无红色标记的为阴性细胞(图1、2)。

　　图1 SAP染色淋巴样小巨核细胞 ×1 000

　　图2 瑞姬氏染色淋巴样小巨核细胞 ×1 000

　　2.2 微小巨核细胞形态

　　分为4型：Ⅰ型为淋巴样小巨核细胞，直径&<12 μm，核圆形且多凹陷，胞浆较少，常有毛状或泡状突起似撕纸状，强嗜碱性呈云雾状，少有颗粒;核多偏一侧，染色质浓集，结构不清，通常无核仁(图1、2)。Ⅱ型为单元核小巨核细胞，直径12～25 μm，胞浆量比淋巴样小巨核细胞多，有突起及伪足，浆内有紫红色粉尘样颗粒，周边常有血小板附着。Ⅲ型为大单元核巨核细胞，直径25～40 μm，胞浆内充满粉尘样颗粒;核圆形或椭圆形，常偏位。Ⅳ型为多元核小巨核细胞，直径12～40 μm，胞浆与单圆核小巨核细胞类似;细胞核多至10余个。

　　2.3 老年贫血各疾病组瑞姬氏染色和SAP染色巨核细胞数量 见表1。SAP染色的骨髓片中巨核细胞数明显高于瑞姬氏染色，两者巨核细胞的检出率差异有统计学意义(P&<0.01)。

　　2.4 107例老年贫血骨髓巨核细胞瑞姬氏染色和SAP染色小巨核细胞阳性率和类型 见表2。表1 瑞姬氏和SAP染色法骨髓片中巨核细胞中位数比较个·片-1

　　染色法不同疾病巨核细胞数量MDSMAIDAMMACDITPHARAAAPRCACAA巨核细胞均数瑞姬氏染色654810922273577856139273.1aSAP染色103791523646616125792613118.4a

　　a 不同方法对各种疾病巨核细胞检出的总体均数

　　注：巨核细胞数用中位数(p50)表示表2 老年贫血各疾病组骨髓巨核细胞瑞姬氏和SAP染色小巨核细胞阳性率和类型

　　贫血类型n小巨核细胞阳性例数SAP染色不同小巨核细胞类型阳性例数瑞姬氏染色SAP染色ⅠⅡⅢⅣ淋巴样小巨核细胞

　　阳性例数MDS199(47.4)15(78.9)a1415131214(73.6)bMA273(11.1)9(33.3)0591—IDA1101(9.1)0100—MM1001(10.0)0010—ACD171(5.9)2(11.8)0110—ITP81(12.5)4(50.0)0310—HA301(33.3)0100—RA200—————AA500—————PRCA300—————CAA200—————

　　a 与MA、IDA、MM、ACD、ITP组比较，P&<0.05; b 与其他组比较，P&<0.01;—表示未检出

　　注：括弧中为所占百分比 通过表2可以看出，不同疾病组比较，MDS组小巨核细胞阳性率最高，4种类型小巨核细胞均可见到;RA、AA、PRCA、CAA组均未见到小巨核细胞。小巨核细胞阳性率由高到低依次为MDS&>ITP&>MA&>ACD&>MM&>IDA。HA组病例少且有1例阳性，未作比较。除MDS组外，ITP、MA组等均未检出淋巴样小巨核细胞。AA、CAA组等疾病骨髓受抑，未检出小巨核细胞，可以认为是与MDS的重要区别。ITP、MA等疾病组虽然可见小巨核细胞，但均未检出淋巴样小巨核细胞。可见Ⅰ型小巨核细胞是MDS的一个重要特征之一。

　　3 讨 论

　　随着我国进入老龄化社会，老年性疾病发病率逐年提高。国内文献报道，老年贫血发生率为7%～28%，占同期住院老年患者的57.3%[3]。本组资料显示，60岁以上老年人MA和MDS发病率分别排在第1和第2位;MA是由于叶酸、VB12缺乏引起细胞内DNA合成障碍，导致细胞核发育障碍所致的骨髓三系细胞核浆发育不平衡及无效造血性贫血，以骨髓中粒系、红系、巨核系三系细胞出现巨幼变为其特征;而MDS是一组获得性造血功能严重紊乱的造血干细胞克隆性疾病，其特点为骨髓中一系或多系血细胞发育异常，伴有不同程度的病态造血[4-5]。因此MDS、尤其在早期的难治性贫血阶段(MDSRA)，其实验室检查、特别是骨髓细胞形态学方面与MA有极多相似之处，给临床诊断及鉴别诊断带来困难。

　　CD41a抗体是血小板膜糖蛋白Ⅱb/Ⅲa的特异性抗体，是巨核细胞血小板系统的独特标记[6]。对于常规瑞姬氏染色形态学难以识别的小巨核细胞(特别是淋巴样小巨核细胞)，通过SAP染色法，小巨核细胞核呈蓝色，胞膜或胞浆呈红色，低倍镜下易于辨认[1，7-8]，因此具有重要的鉴别意义。

　　目前病态小巨核细胞已被列为MDS的诊断指标之一[9]。由于临床常规进行巨核细胞检查，一般是先在低倍镜下进行巨核细胞计数，然后换油镜分类，所以与淋巴细胞、幼红细胞大小相似的小巨核细胞往往容易漏检，从而延误诊断。采用SAP染色法可以明显提高小巨核细胞的检出率，对于MDS的早期诊断及其鉴别诊断具有重要的临床价值。SAP染色法比传统的APAAP染色法、亲和素生物素过氧化物酶法更加敏感、特异[1，10]，具有操作简便、结果易观察、成本低等优点。

　　综上所述，本研究应用CD41标记的SAP染色有助于对老年性贫血的诊断和鉴别诊断，特别是对老年MDS的诊断有极其重要的临床意义，为早期治疗提供可靠的依据。

参考文献

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　　[4] 范贤斌，徐志，卢兴国.巨幼细胞性贫血及骨髓增生异常综合症病态巨核细胞和多小核细胞核象的观察[J].中国实验诊断学，2006，10:12141215.

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　　[9] 赵新民.小儿骨髓增生异常综合症诊疗建议[J].中国实用儿科杂志，1999，14:442443.

　　[10] COOPER K， IIAFFAJEE Z， TAYLOR L.Comparative analysis of biotin intranuclear inclusions of gestational endometrium using the APAAP，ABC and the PAP immunodetection systems[J]. J Clin Pathol，1997，50:153156.