α干扰素对人肺腺癌A549细胞生物学行为的影响

　　　　 作者：姜纯国，孙思庆，朱晓莉，林勇

【摘要】 　　目的：研究IFNα对人肺腺癌A549细胞株克隆形成、迁移和侵袭能力以及细胞凋亡的影响。方法：用不同浓度（100、500、1 000、2 000 U·ml-1）IFNα处理人肺腺癌A549细胞（实验组），以未经药物处理细胞作对照(对照组)，平板克隆形成实验观察两组细胞克隆形成能力的差异，Transwell小室实验观察两组细胞迁移和侵袭能力的差异，流式细胞仪观察两组细胞凋亡水平的差异。结果：IFNα能够明显降低人肺腺癌A549细胞克隆形成、迁移和侵袭能力，诱导细胞的凋亡，而且在一定范围内与药物浓度成正相关(P＜0.05)。结论：IFNα在非小细胞肺癌临床治疗中可能有潜在价值。

【关键词】 干扰素α； 人肺腺癌细胞； 生物学行为

　　［Abstract］ Objective：To study the influence of interferonα(IFNα) on the colony formation，migration， invasion and apoptosis of human lung adenocarcinoma A549 cell line.Methods：Human lung adenocarcinoma A549 cells were treated with a concentration of 100，500，1 000，2 000 U·ml-1IFNα，respectively.The ability of cell clone formation was detected by the plate colony forming assay.The cell migration and invasion ability were observed in Transwell chamber.The apoptosis was analyzed by flow cytometry.Results：The ability of cell colony formation，migration and invasion were significantly reduced.IFNα coulde induce cell apoptosis in a concentrationdependent manner(P＜0.05).Conclusions：IFNα may have potential value in nonsmall cell lung cancer treatment.

　　［Key words］ interferonα; lung adenocarcinoma cell; biological behavior
　　
　　干扰素是一种具有多种生物活性的细胞因子，近年来α干扰素（IFNα）对肿瘤的作用逐渐受到重视。实验表明，在体内外干扰素都能够控制肿瘤生长，抑制肿瘤复发转移，但IFNα对非小细胞肺癌细胞的增殖、迁移、凋亡能力的影响还不十分确切。本研究的目的是探讨IFNα对人肺腺癌A549细胞的生物学行为影响，为进一步深入了解IFNα的抗肿瘤作用与非小细胞肺癌发病机制之间的关系奠定基础。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 材料
　　
　　人肺腺癌细胞株A549购自中国科学院上海细胞生物研究所。主要试剂有IFNα（上海生物制品研究所）、RPMI1640培养液(GIBCO公司)、胎牛血清（杭州四季清公司）、胰蛋白酶（GIBCO公司）、Matrigel胶（美国BD公司）、Annexin VFITC及PI细胞凋亡检测试剂盒（南京凯基生物公司）。主要实验耗材有插入式细胞培养池（Transwell，Corning公司）。
　　
　　1.2 方法

　　1.2.1 平板克隆形成实验观察细胞克隆形成能力

　　将对数生长期的人肺腺癌A549细胞以750孔-1均匀接种于6孔板中，每孔加2 ml培养液，以十字方向轻轻晃动6孔板，使细胞分散均匀。培养24 h后分别给予100、500、1 000、2 000 U·ml-1 IFNα处理（实验组），并设不加药的对照组。每组设3个复孔，静止培养2周（100、500、1 000、2 000 U·ml-1 IFNα处理5 d后更换等体积RPMI1640培养液继续培养至2周）。弃去培养液，用PBS洗2次。加甲醇2 ml固定10 min，弃去甲醇，待其自然挥发至干，加入Giemsa染液10～15 min（根据温度而定）；自来水冲去染液，空气干燥。实验重复3次。肉眼直接计数克隆数。

　　1.2.2 Transwell小室实验观察细胞迁移能力

　　将人肺腺癌A549细胞悬液（5×105 ml-1）接种于24孔Transwell小室上层，小室下层放适量小鼠NIH3T3细胞的无血清培养液。实验组在小室上层加入含IFNα（100、500、1 000、2 000 U·ml-1）的RPMI1640培养液，对照组加入等体积RPMI1640培养液，每组设3个复孔。37 ℃孵育12 h后终止实验，棉签擦去上层未迁移的细胞，用苏木精伊红染色并与于高倍镜视野下计数5个视野的细胞数，取其均值并统计分析。

　　1.2.3 Transwell小室实验观察细胞侵袭能力

　　将A549细胞悬液（5×104 ml-1）加入涂有1∶1Matrigel胶的24孔Transwell小室上层，其后如前所述，小室下层放适量小鼠NIH3T3细胞的无血清培养液。实验组在小室上层加入含IFNα（100、500、1 000、2 000 U·ml-1）的RPMI1640培养液，对照组加入等体积RPMI1640培养液，每组设3个复孔。37 ℃孵育24 h后终止实验，棉签擦去上层未侵袭的细胞，用苏木精伊红染色并与于高倍镜视野下计数5个视野的细胞数，取其均值并统计分析。

　　1.2.4 流式细胞仪观察细胞凋亡水平

　　收集含IFNα（100、500、1 000、2 000 U·ml-1）的RPMI1640培养液培养72 h的细胞及RPMI1640培养液培养的细胞，常规胰酶消化后，制成单细胞悬液，离心弃上清液，再经预冷的PBS洗2次，按Annexin V/FITC及PI试剂盒提供方法依次加入结合缓冲液、Annexin V/FITC及PI，室温避光15 min后上机测试，采用FACS Calibur流式细胞仪对样品进行检测，每次计细胞数10 000个，激发波长为488 nm，用分析软件CellQuest计算凋亡率。实验重复3次。

　　1.3 统计学处理
　　
　　采用SPSS 11.5软件包进行统计学分析，计量数据用x-±s表示，组间比较用单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 IFNα对人肺腺癌A549细胞克隆形成的影响
　　
　　肺腺癌A549细胞经1周培养能形成类圆形细胞集落，其后逐渐增大。培养2周结果显示，IFNα对人肺腺癌A549的克隆形成能力随浓度的增大而降低，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(F=1.614，P＜0.05)，见图1、表1。表1 不同浓度的IFNα对人肺腺癌A549细胞克隆形成的影响（略）

　　2.2 IFNα对肺腺癌A549细胞迁移能力的影响
　　
　　Transwell小室实验结果显示，IFNα对A549的细胞迁移能力随浓度的增高而降低，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(F=1.473，P＜0.05)，见图2、表2。表2 不同浓度的IFNα对人肺腺癌A549细胞迁移能力的影响（略）

　　2.3 IFNα对肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响
　　
　　Transwell小室实验结果显示，IFNα对A549的细胞侵袭能力随浓度的增高而降低，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(F=3.013，P＜0.05)，见图3、表3。表3 不同浓度的IFNα对人肺腺癌A549细胞侵袭能力的影响（略）
　　
　　通过AnnexinV/PI双染色流式分析图以及数据发现，IFNα对人肺腺癌A549的细胞凋亡水平随浓度的增大而降低，且不同浓度组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)，见图4。
　　
　　3 讨论
　　
　　肺癌是严重危害人类健康的疾病，其发病率和死亡率均较高，目前对该病的病因及发病机制认识尚不清楚。干扰素(interferon，IFN)，包括IFNα、β、γ及其他亚型，作为目前研究最多、唯一具有抗病毒和抗肿瘤双重作用的生物反应调节剂，越来越受到重视，但干扰素抗肿瘤的具体机制尚不清楚。本研究利用人肺腺癌细胞株A549进行实验，以IFNα进行实验干预，观察IFNα对人肺腺癌细胞生物学行为的影响。
　　
　　通过平板克隆形成实验我们发现，人肺腺癌A549细胞的克隆形成能力随IFNα浓度的增高而降低，可以认为IFNα对肺腺癌的生长有显著的抑制作用。而对经IFNα处理人肺腺癌A549细胞进行Annexin V/PI细胞凋亡的检测，通过流式细胞仪检查发现，细胞凋亡数目明显多于对照组，提示干扰素抑制肿瘤细胞的作用机制可能是通过诱导肿瘤细胞凋亡实现的，这和之前相关报道［1-3］结果一致。IFNα调节的转录因子如STAT、IRF家族是诱导细胞凋亡的重要介导因子。IFNα可以通过依赖或非依赖于P53的路径，抑制细胞周期进程，促进细胞凋亡［4］。此外许多研究表明，IFNα能诱导TNFα与TRAIL的产生和分泌，共同增强细胞的死亡。
　　
　　本研究选用了Transwell小室的实验模型，这是目前测定细胞体外迁移和侵袭能力的理想模型。应用该模型了解IFNα对肿瘤细胞迁移和侵袭作用的影响，发现IFNα作用于人肺腺癌A549细胞后，迁移和侵袭能力明显受到抑制，穿膜细胞数明显减少，表明IFNα可以在体外实验中抑制人肺腺癌细胞A549的迁移和侵袭。有研究结果显示，IFNα对实验性大鼠肝癌及临床肝细胞癌根治性切除术后的转移复发有抑制作用［5］，但干扰素抗肿瘤迁移的具体机制尚未明确。另外，亦有学者认为，IFNα可以诱导内皮细胞表达多种黏附分子，包括细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule1，ICAM1)、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule，VCAM1)等［6］，而这些黏附分子对于淋巴细胞的迁移都起着重要作用。
　　
　　非小细胞肺癌是肺癌常见的类型，预后较差，治疗易产生耐药。生物治疗是近年来科学工作者广泛认同的较为理想的肿瘤治疗方法，但生物治疗对非小细胞肺癌的疗效甚微。进一步揭示IFNα的具体作用以及和非小细胞肺癌发病机制之间的关系将有可能在免疫学领域丰富非小细胞肺癌治疗策略和手段。

参考文献

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