稳定的水溶性Fe3O4纳米粒子的制备及其表征

　　　　 作者：吴利清，张熙之，方芳，王怡红，张宇，顾宁

【摘要】 目的：制备稳定的水溶性Fe3O4纳米粒子(PMATFe3O4)磁共振成像(MRI)造影剂，并对合成的粒子进行表征。方法：利用高分子聚1十四碳烯马来酸酐(PMAT)修饰油溶性Fe3O4纳米粒子表面，使粒子表面富含亲水性羧基基团，使粒子能够稳定存在于水相中，并用透射电镜(TEM)、动态光散射(DLS)、振动样品磁强计(VSM)、傅立叶红外吸收光谱(FTIR)和MRI等方法进行表征。结果：(1) TEM分析显示，PMATFe3O4粒子直径约为10 nm，DLS测定其水动力学平均直径约为80 nm;(2) PMATFe3O4粒子能稳定分散于去离子水、PBS、Tris、MES等缓冲液中，不发生团聚;(3) VSM、MRI等分析手段显示，PMATFe3O4的饱和磁化强度Ms≈14.0 emu·g-1，弛豫率r2=367.79 mM-1s-1。结论：PMATFe3O4具有良好的水溶性、磁学性能和较高的r2值，有望发展成为一种性能优异的MRI造影剂。

【关键词】 Fe3O4纳米粒子; 表面修饰; 聚合物; 弛豫率

　　[Abstract] Objective: To synthesize stable and watersoluble PMATFe3O4 nanoparticles(NPs) as MRI contrast agent and characterize it. Methods: Poly maleic anhydride alt1tetradecene(PMAT) was utilized to modify the surface of oilsoluble NPs， and the obtained PMATFe3O4 NPs were characterized by TEM， DLS， FTIR， VSM and MRI. Results: (1) TEM and DLS studies showed that the PMATFe3O4 NPs have a magnetic core size of about 10 nm and a hydrodynamic diameter of about 80 nm.(2) PMATFe3O4 could keep stable in water and familiar buffers， such as MES， PBS and Tris without aggregation.(3) VSM measurements showed that the saturation magnetization(Ms) was about 14.0 emu·g-1， the relaxivity value(r2) of PMATFe3O4 was 367.79 mM-1s-1. Conclusion: The obtained PMATFe3O4 NPs possess outstanding watersolubility， good magnetic properties， and high r2 value， which are therefore expected to become an excellent MRI contrast agent.

　　[Key words] Fe3O4 nanoparticles; surface modification; polymer; relaxivity

　　磁性纳米粒子(NPs)在生物技术和生物制药等领域已显示出良好的应用前景[1]。氧化铁纳米粒子由于具有独特的磁学性质和良好的生物相容性，研究其作为造影剂在磁共振成像(MRI)技术方面的应用，已成为发展最为迅速和最为重要的课题之一。其中，化学制备具有稳定水溶性和高弛豫率(r)的磁性氧化铁纳米粒子是一个重要的研究方向。r的大小是考察氧化铁纳米粒子是否具有良好造影能力的重要参数，它分为r1和r2两种，分别代表了单位浓度粒子缩短体系内质子弛豫时间T1和T2的效率[2-4]。本实验利用高分子聚1十四碳烯马来酸酐(poly maleic anhydride alt1tetradecene， PMAT)，对油溶性的油酸包覆的Fe3O4纳米粒子(oleicFe3O4)进行表面修饰，使其能够稳定分散于水相中，获得水溶性Fe3O4纳米粒子(PMATFe3O4)，研究表明，该种纳米粒子具有较高弛豫率r2值，能够作为良好的MRI造影剂。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　PMAT(SigmaAldrich)、透析袋(50 KDa)、oleicFe3O4(参照文献[5]报道，本实验室制备)。

　　1.2 主要试剂

　　氯仿(上海市四赫化工有限公司)，碳酸盐缓冲液(pH 10.8)、MES缓冲液(pH 6.0)、PBS缓冲液(pH 7.4)、Tris缓冲液(pH 8.0)(缓冲液均为本实验室配制)，正己烷(上海市实德化学有限公司)，去离子水。

　　1.3 实验方法

　　1.3.1 PMATFe3O4纳米粒子制备

　　称取0.05 g oleicFe3O4固体粉末和0.2 g PMAT，分别溶于10 ml氯仿中，超声5 min后，室温下于50 ml烧瓶中混合搅拌反应4 h。旋转蒸发除去溶剂氯仿，得到黑色固体。在氮气保护下，将黑色固体加入30 ml碳酸盐缓冲液，50 ℃下在100 ml三颈瓶中剧烈搅拌反应3 h，得到稳定的黑色水溶性PMATFe3O4纳米粒子。

　　1.3.2 提纯

　　将以上PMATFe3O4纳米粒子用220 nm滤膜过滤后，置于磁场下磁分离，待分层明显后，取下部磁性物质重新分散于10 ml去离子水中，用去离子水透析24 h，透析过程中换去离子水3次，得到纯净的分散于水中的PMATFe3O4纳米粒子。

　　1.3.3 表征

　　运用多种分析手段对所制备的粒子进行表征，研究其作为造影剂的性能。

　　1.3.3.1 Fe浓度测定 使用邻二氮菲分光光度法[6]对样品的Fe浓度进行测定。制备了3个浓度梯度的样品待测，其中Fe含量比为2 ∶1 ∶ 0，测得Fe浓度为1.7 mg·ml-1。

　　1.3.3.2 透射电镜(TEM)分析 将样品用去离子水稀释后，滴1滴于TEM专用铜网上，40 ℃下真空烘干8 h，待测。仪器型号为JEM200CX。

　　1.3.3.3 动态光散射(DLS)分析 将样品用去离子水稀释至Fe浓度为0.5 mg·ml-1后，室温下测定其水动力学粒度分布。仪器型号为Malvern ZetaSize 3000HS。

　　1.3.3.4 傅立叶红外吸收光谱(FTIR)分析 取1 ml制备的PMATFe3O4溶液，以6 mol·L-1盐酸调至等电点，析出的黑色固体用去离子水洗涤3次，40 ℃真空干燥，得到黑色固体粉末，待测。仪器型号AVATAR 360FTIR。

　　1.3.3.5 振动样品磁强计(VSM)分析 制样同FTIR。仪器型号为Lakeshore 7400。

　　1.3.3.6 MRI 准确配制Fe浓度为5、2.5、1.25、0.625、0.312 5、0.156 25 μg·ml-1 PMATFe3O4溶液，各取1.4 ml液体于1.5 ml离心管中，待测。室温下，MRI实验磁场强度为7.0 T，自旋回波序列，脉冲重复间隔时间TR为2 500 ms，回波时间TE分别为11.0、22.0、33.0、44.0、55.0、66.0、77.0、88.0、99.0、110.0、121.0、132.0、143.0、154.0、165.0和176.0 ms。仪器型号为Bruker Pharma Scan，7.0 T，孔径为16 cm，最大梯度强度为300 mT·m-1。

　　2 结 果

　　2.1 粒度分析

　　使用PMAT修饰后，PMATFe3O4可以稳定存在于水环境中，包括MES、PBS、Tris等缓冲液体系中。在4 ℃条件下，粒子可以长时间保存不发生沉积。TEM分析显示，PMATFe3O4分散性良好(图1)，这主要是由于粒子间的静电排斥作用和空间位阻作用的结果，但是小的聚集体仍然存在。PMATFe3O4纳米粒子的直径约为10 nm，与油溶性oleicFe3O4相比，粒度并无明显改变。DLS分析显示，在水环境中，PMATFe3O4的水动力学平均直径约为80 nm(图2)，明显高于TEM测得的尺寸，这可能有两个原因：(1) DLS统计的是纳米粒子在水环境中的整体尺寸，包括表面有机物壳层和水化层对粒径大小的贡献，而修饰在粒子表面的有机物分子包裹层并不能在TEM图中显示出来;(2) 有几个Fe3O4纳米粒子被PMAT包裹成一个整体，形成一个相对较大的PMATFe3O4粒子，影响了粒子的整体尺寸分布。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4

　　2.2 FTIR分析

　　通过对粒子红外图谱的分析，可以获得粒子的化学结构信息，见图3。a和b曲线中，2 850 cm-1和2 930 cm-1的吸收峰表明粒子中存在大量的甲基与亚甲基基团，同时，由于大量有机聚合物PMAT的存在，PMATFe3O4中FeO伸缩振动吸收峰(593 cm-1)的强度[7]并不如oleicFe3O4高;b曲线中，1 707 cm-1的吸收峰表明体系中大量羰基(C=O)的存在，这是由于大量酸酐水解产生羧基所导致，同时a曲线的羰基吸收峰很不明显。PMATFe3O4纳米粒子表面羧基所带负电荷是其能够稳定分散于水环境中的原因之一。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4

　　2.3 磁性分析

　　磁滞回线显示，oleicFe3O4的饱和磁化强度Ms为57.0 emu·g-1，PMATFe3O4的饱和磁化强度Ms值约为14.0 emu·g-1，见图4。a. oleicFe3O4; b. PMATFe3O4由图4可见，修饰后Ms值下降了很多，这可能是由于受到粒子表面较厚的有机修饰物的影响，尽管如此，还是能够满足常用的生物应用要求，很多报道证明了这一点[8-9]。修饰前oleicFe3O4的矫顽力为0.183 Oe，修饰后只有微小改变，为0.141 Oe，很接近于0，说明Fe3O4磁核具有良好的超顺磁性[10-11]，适合作MRI造影剂。超顺磁性是指磁性粒子尺寸小于某一临界尺寸时，表现出矫顽力为零，室温热即能够克服磁各向异性使磁矩能够任意翻转的状态。当存在外磁场时，超顺磁性粒子能够被迅速磁化，表现出较强的磁性，一旦撤去外磁场，则磁性消失，表现出平均磁化强度为零的状态[12]。

　　r是反映磁性粒子磁学性质的重要物理量，是粒子作为造影剂的重要参数，定义为单位浓度(mmol·L-1)活性离子所导致的水溶液弛豫速度的增加。r的确定需要测量样品在不同浓度时的弛豫时间T。T又分为T1和T2，T1为纵向弛豫时间，又称自旋晶格弛豫时间，T2为横向弛豫时间，又称自旋自旋弛豫时间[13]。以测定氧化铁纳米粒子r2为例。一般地，MR信号强度(SI)可表示为：SI=S0(eTE/T2)(1eTR/T1)，式中TR为重复时间，TE为回波时间，S0是常数。当TR趋于无穷大，1eTR/T1项接近1，所以可排除T1的影响。假设TR远大于T1，上述方程可简化为：SI=S0(eTE/T2)，将方程两边取对数，得：ln(SI)=ln(K)-TE/T2，通过测量不同回波时间的MR信号强度并根据计算公式进行指数拟合，可得到不同浓度材料的T2值。PMATFe3O4在不同Fe浓度下测得的T1和T2值见表1。表1 PMATFe3O4纳米粒子弛豫时间T与Fe浓度关系

　　T2与T1相比，其值远小于T1，且梯度关系明显;经过线性模拟计算，r1=0.34 mM-1s-1，r2=367.79 mM-1s-1，r1远小于r2。对于氧化铁纳米粒子，r表示含有1 mmol·L-1 Fe的水溶液相对于纯水的弛豫速度的增加，可表达为下式：1/T1=1/T1([Fe]=0)+r1[Fe];1/T2=1/T2([Fe]=0)+r2[Fe]。式中1/T为样品弛豫时间的倒数，即弛豫速度;1/T([Fe]=0)为Fe浓度为0时的弛豫速度，即纯水弛豫速度;[Fe]为样品体系中Fe的浓度。以弛豫速度(1/T1，1/T2，s-1)作为[Fe](mmol·L-1)函数，绘制线性拟合图，拟合直线的斜率即为所测粒子的r，见图5。结果显示，PMATFe3O4具有较高的r2，为367.79 mM-1s-1，而其r1值则十分小，约为0.34 mM-1s-1，说明其可作为良好的T2造影剂。

　　将PMATFe3O4纳米粒子作为T2阴性造影剂所得MRI图像，见图6。磁场强度为7.0 T，实验环境为室温，TE=66.0 ms。由图6可见，信号强度从强到弱，Fe浓度分别为0.156 25、0.312 5、0.625、1.25、2.5、5 μg·ml-1，可以看出，作为阴性造影剂，随着Fe浓度的升高，PMATFe3O4的造影能力增强，梯度变化明显，与其高r2值相对应。图5 PMATFe3O4弛豫速度与样品Fe浓度关系

　　3 讨 论

　　用来修饰纳米粒子的分子种类很多，常见的有无机分子，如Au[2]、Si[14]等;有机小分子，如二巯基丁二酸(DMSA)[15]等;而有机大分子由于其良好的生物相容性和来源广泛，亦得到了广泛的应用，常用的有聚乙烯吡咯烷酮(PVP)[16]、葡聚糖、聚乙二醇(PEG)[17]等。

　　修饰物连接于Fe3O4纳米粒子表面的机理可以分为两种基本模式，第一种是表面修饰物非共价吸附，即修饰后修饰物与纳米粒子表面并不形成新的共价键，修饰物通过非共价键连接在纳米粒子表面，主要作用力有范德华力、疏水作用、静电吸附等，这种方式主要应用于一些具有较长碳链的有机大分子修饰，静电力与空间位阻都对修饰后粒子的稳定性具有积极作用;第二种是修饰物改变，即新的修饰物将纳米粒子表面已有的修饰物取代，新的修饰物与纳米粒子表面以共价键相连接，这种方式可以在粒子表面引入目标分子，也可以取得良好的效果[18-19]。

　　PMAT是一种两亲性聚合物，其中疏水烷基链可能是以疏水作用非共价吸附并包裹于oleicFe3O4表面，即采用上述的第一种模式，使纳米粒子表面富含亲水性官能团羧基。PMAT大分子所提供的空间位阻和羧基所带有的负电荷(静电作用)是PMATFe3O4粒子能够稳定存在于水相中的两种主要作用力。经过修饰后，PMATFe3O4纳米粒子可以稳定分散于水相中，包括MES、PBS、Tris等缓冲液体系，且能长时间保持稳定，不发生团聚，同时，PMATFe3O4具有较高的r2，为367.79 mM-1s-1，提示其可作为一种潜在的MRI造影剂。作为对比，本实验测定了相同条件下市售产品Feridex[20]的r2，约为221.69 mM-1s-1，远比PMATFe3O4的r2值小。

　　影响磁性纳米粒子r大小的因素有粒子的饱和磁化强度、晶体组成成分、晶格形式、尺寸大小和粒子优化修饰等。已有研究报道，较大的粒子尺寸和粒子的聚集均会提高粒子r[1]。本实验中，晶体组成成分和晶格形式都不会发生变化，但是PMATFe3O4磁核的粒径比Feridex相对较大，且通过观察TEM电镜图，可以发现会有2-3个粒子被聚合物包裹在一起，形成稳定的聚集体，即增大了粒子的尺寸分布，所以，PMATFe3O4相对较高的磁性粒子尺寸分布直径导致了其较高的r2，而高r是纳米粒子具有优良造影剂能力的重要参数。

　　本实验采用PMAT修饰油溶性oleicFe3O4纳米粒子，修饰后PMATFe3O4纳米粒子能稳定分散于水相中，具有较高的r2，可以作为优良的T2阴性MRI造影剂。

参考文献

　　[1] JUN Y W， LEE J H， CHEON J. Chemical design of nanoparticle probes for highperformance magnetic resonance imaging[J]. Angsw Chem Int Ed Engl， 2008，47(28):51225135.

　　[2] SUNG J C， BENJAMIN R J， ANGELIQUE Y L， et al. Goldcoated iron nanoparticles: a novel magnetic resonance agent for T1 and T2 weighted imaging[J]. Nanotechnology， 2006，17(3):640644.

　　[3] BILLOTEY C， WILHELM C， DEVAUD M， et al. Cell internalization of anionic maghemite nanoparticles: Quantitative effect on magnetic resonance imaging[J]. Magn Reson Med， 2003，49(4):646654.

　　[4] JA Y P， EUN S C， MYUNG J B， et al. Watersoluble ultra small paramagnetic or superparamagnetic metal oxide nanoparticles for molecular MR imaging[J]. Eur J Inorg Chem， 2009，17:24772481.

　　[5] LAN Q， LIU C， YANG F， et al. Synthesis of bilayeroleic acidcoated Fe3O4 nanoparticles and their application in pHresponsive pickering emulsions[J]. Colloid and Interface Science， 2007，310(1):260269.

　　[6] 姜健. 分光光度法测定自来水中铁含量[J].辽宁化工，2005，34(4):125128.

　　[7] 杨瑞成，郧栋，穆元春，等.纳米Fe3O4磁流体的制备及表征[J].兰州理工大学学报，2008，34(1):2225.

　　[8] PEDRO T， CARLOS J S. Synthesis of Monodisperse superparamagnetic Fe/Silica nanospherical composites[J]. Am Chem Soc， 2003，125(51):1575415755.

　　[9] LU H C， Yi G S， ZHAO S Y， et al. Synthesis and characterization of multifunctional nanoparticles possessing magnetic， upconversion fluorescence and bioaffinity properties[J]. Mater Chem， 2004，14:13361341.

　　[10] 杨玉东，于忠淇，潘卫三，等.超顺磁性造影剂的研究进展[J].现代生物医学进展，2007，7(9):13871390.

　　[11] 娄敏毅，王德平，贾秋凌，等.纳米Fe3O4磁性粒子合成过程中分散体系的影响[J].建筑材料，2005，8(2):69173.

　　[12] SOPHIE L， DELPHINE F， ROBERT N M， et al. Magnetic iron oxide nanoparticles: synthesis， stabilization， vectorization， physicochem ical characterizations， and biological applications[J]. Chem Rev， 2008，108(6):20642110.

　　[13] 赵喜平.磁共振成像系统的原理及其应用[M].北京:科学出版社，2000：885887.

　　[14] ZHAO W R， GU J， ZHANG L， et al. Fabrication of uniform magnetic nanocomposite spheres with a magnetic core/mesoporous silica shell structure[J]. Am Chem Soc， 2005，127(25):89168917.

　　[15] CHEN Z P， ZHANG Y， ZHANG S， et al. Preparation and characterization of watersoluble monodisperse magnetic iron oxide nanoparticles via surface doubleexchange with DMSA[J]. Colloids and Surfaces A: Physicochem Eng Aspects， 2008，316(13):210216.

　　[16] LIU H L， SEUNG P K， WU J H， et al. Onepot polyol synthesis of monosize PVPcoated sub5nm Fe3O4 nanoparticles for biomedical applications[J]. Magnetism and Magnetic Materials， 2007，310(2):815817.

　　[17] ZHANG J， RANA S， SRIVASTAVA R S， et al. On the chemical synthesis and drug delivery response of folate receptoractivated， polyethylene glycolfunctionalized magnetite nanoparticles[J]. Acta Biomaterialia， 2008，4(1):4048.

　　[18] MICHALET X， PINAUD F F， BENTOLILA L A. Quantum dots for live cells， in vivo imaging， and diagnostics[J]. Science， 2005，307:538540.

　　[19] MEDINTZ I L， UYEDA H T， GOLDMAN E R， et al. Quantum dot bioconjugates for imaging， labelling and sensing[J]. Nature Mater， 2005，4:435450.

　　[20] LI W， SEAN T， ANTHONY T V， et al. Firstpass contrastenhanced magnetic resonance angiography in humans using ferumoxytol， a novel ultrasmall superparamagnetic iron oxide(USPIO)based blood pool agent[J]. Magn Reson Imaging， 2005，21(1):4650.