重组人生长激素对裸鼠胃癌移植瘤生长及血清VEGF浓度的影响

【摘要】 　　目的：研究重组人生长激素(rhGH)对裸鼠人胃癌移植瘤生长及血清VEGF水平的影响。方法：取60只雄性裸鼠进行实验，通过免疫细胞化学染色法检测胃癌细胞株SGC7901及MKN45生长激素受体(GHR)的表达状况，将GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC7901及GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN45分别接种于4只裸鼠皮下，制作裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，3周后取出移植瘤制成组织匀浆，接种于剩余52只裸鼠。依据接种细胞种类不同分为移植瘤GHR阳性表达和GHR阴性表达裸鼠，不同GHR表达的裸鼠进一步分为对照组(C组：予0.9%NaCl，0.2 ml·d-1)、rhGH低剂量组(L组：予rhGH 0.5 U·kg-1·d-1)、rhGH高剂量组(H组：予rhGH 2.5 U·kg-1·d-1)，连续给药14 d，观察并记录各组裸鼠体重和肿瘤体积变化，酶联免疫吸附法测定血清VEGF含量。结果：SGC7901为GHR阳性表达的人胃癌细胞株，MKN45为GHR阴性表达的人胃癌细胞株。对于接种GHR阳性表达的人胃癌细胞株的裸鼠，rhGH给药组皮下移植瘤体积较对照组增大(P&<0.05)，且H组促增长效应显著(P&<0.05)，3组间体重差异不明显(P&>0.05)；血清VEGF检测，L组为（167.60±9.54 ） pg·ml-1，H组为（252.94±15.32 ） pg·ml-1，较C组（49.94±5.73） pg·ml-1升高(P&<0.05)；对于接种GHR阴性表达的人胃癌细胞株的裸鼠，L组、H组体重均大于对照组(P&<0.05)，而3组之间肿瘤体积大小、血清VEGF水平比较差异均无统计学意义(P&>0.05)。结论：rhGH能促进GHR阳性表达的胃癌细胞株SGC7901移植瘤生长，并促进血清VEGF表达增高；对GHR阴性表达的胃癌细胞株MKN45移植瘤没有表现出明显的促肿瘤生长及促血清VEGF表达效应。GHR表达情况可能是rhGH影响血清VEGF分泌的关键靶点之一。

【关键词】 重组人生长激素； 生长激素受体； 血管内皮生长因子； 胃癌

　　[Abstract] Objective：To investigate the effects of recombinant human growth hormone(rhGH) on tumor growth and serum VEGF levels of human gastric carcinoma xenografts in nude mice.Methods：Sixty male nude mice were bought for the experiment.Immunocytochemistry method was used to detect the expression of growth hormone receptor(GHR) in human gastric carcinoma cell lines SGC7901 and MKN45. Human gastric cell line SGC7901 with a positive expression of GHR and human gastric cell line MKN45 with a negative expression of GHR were injected subcutaneously into 4 nude mice respectively to create the subcutaneous xenografts models derived from human gastric carcinoma in nude mice.Three weeks later，the xenografts were picked out to make homogenate.Then injected subcutaneously into the remaining 52 nude mice.According to the different types of the injected cells， the nude mice were pided into GHR positive group and GHR negative group，then pided into three experimental groups:control group(C group:0.9%NaCl was given 0.2 ml·d-1)， lowdose rhGH group(L group:rhGH was given 0.5 U·kg-1·d-1) ，and highdose rhGH group(H group:rhGH was given 2.5 U·kg-1·d-1)，once a day for 14 days.The changes of body weight and tumor volume of nude mice in each group were recorded.The serum concentrations of VEGF in peripheral blood were analyzed by ELISA.Results:We defined SGC7901 as GHR positive group and MKN45 as GHR negative one.For GHR positive groups，the tumor volumes were significantly larger in rhGH administration groups than in the C group(P&<0.05)，and the H group revealed greater effect(P&<0.05).No significant difference was found in body weight of the mude mice among the 3 groups(P&>0.05).The serum VEGF concentrations of the L group and H group were (167.60±9.54) pg·ml-1 and (252.94±15.32) pg·ml-1 respectively， much higher than which of the C group， with only (49.94±5.73) pg·ml-1（P&<0.05）；While for GHR negative groups， the body weights of the nude mice increased with the concentration of rhGH(P&<0.5)， but no obvious effect on tumor growth and serumVEGF secretion was observed(P&>0.05).Conclusion：RhGH can promote the growth of tumor，and increase the expression of serum VEGF in the SGC7901 xenograft tumor model in which GHR is highly expressed.But not for the MKN45 xenograft tumor model in which the expression of GHR is almost undetectable.

　　［Key words］ recombinant human growth hormone; growth hormone receptor; vascular endothelial growth factor; gastric carcinoma

　　胃癌患者发生营养不良较为常见，治疗应以延长患者生存期、改善生活质量为目标，不能仅仅针对肿瘤组织本身，应重视代谢支持与调理的作用，从整体增强机体免疫机能，从而提高抗肿瘤治疗疗效。重组人生长激素(recombinant human growth hormone，rhGH)在改善患者营养状况、调节免疫功能方面存在优势。由于生长激素(growth hormone，GH)具有促细胞有丝分裂效应，理论上具有潜在的促肿瘤生长作用，故其能否用于恶性肿瘤患者的代谢调理仍有争议。有报道［1］认为，rhGH不仅可促进肿瘤细胞增殖，而且可能与肿瘤血管新生有关，但尚无明确的理论证据。生长激素受体(growth hormone receptor，GHR)的存在，则是GH发挥其生物学效应的关键［2-3］。本研究通过建立GHR差异表达的裸鼠胃癌皮下移植瘤模型，给予不同剂量的rhGH干预，了解动物体内rhGH对肿瘤生长及血清中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)表达的影响。
　　
　　1 材料和方法
　　
　　1.1 细胞株和实验动物
　　
　　人低分化胃癌细胞株SGC7901和MKN45购自中国科学院上海细胞生物研究所。BALBc，nunu，雄性裸鼠60只，购自上海斯莱克实验动物有限公司，鼠龄4～5周，体重14～16 g，无特定病原体(SPF)条件下饲养。
　　
　　1.2 主要药物和试剂
　　
　　注射用重组人生长激素rhGH(珍怡)为上海联合赛尔生物工程有限公司产品。兔抗人GHR多克隆抗体，小鼠VEGF ELISA试剂盒，SABC免疫细胞化学试剂盒均购自武汉博士德生物技术有限公司。
　　
　　1.3 实验方法

　　1.3.1 胃癌细胞的GHR表达检测

　　胃癌细胞株SGC7901和MKN45均在含10％胎牛血清的RPM1640、37 ℃、体积分数为5％的CO2饱和湿度培养箱中培养。应用免疫细胞化学染色测定SGC7901和MKN45的GHR表达情况。操作步骤按说明书进行。细胞膜或细胞质棕黄色或棕褐色并呈颗粒状为阳性。高倍镜下(×200)随机选择5个视野并分别计数100个细胞，根据阳性细胞占计数细胞的百分比，将免疫染色分级如下：阴性(-)，染色细胞≤5％；弱阳性(+)，染色细胞为6％～25％；中等阳性(++)，染色细胞为26％～50％；强阳性(+++)，染色细胞≥51%。

　　1.3.2 裸鼠胃癌皮下移植瘤模型的建立

　　取处于对数生长期的胃癌细胞SGC7901和MKN45细胞，分别用0.25%胰蛋白酶消化制成单细胞悬液，台盼蓝拒染法计数活细胞数占95%以上。收集细胞，调节浓度为2×107个·ml-1，随机选取4只裸鼠，右前肢腋下接种SGC7901细胞，0.2 ml·只-1，同法，再取4只，接种MKN45细胞。7 d后接种部位可触及肿瘤组织，3周后可见直径1.5～2 cm肿块。引颈处死裸鼠，皮肤消毒，无菌条件下于右前肢腋下取出瘤块，置于有少许生理盐水的培养皿中，去掉坏死组织，称重，按瘤块重量，每 1 g 肿瘤加入4 ml生理盐水，于组织匀浆器中研磨，配成混悬液，浓度约为1～2×107个·ml-1，给26只实验裸鼠右前肢腋下接种SGC7901细胞的组织匀浆，0.2 ml·只-1，同法将MKN45细胞的组织匀浆接种于另26只裸鼠右前肢腋下。10 d后可见52只裸鼠右前肢腋下均形成直径约0.5 cm的肿瘤。

　　1.3.3 实验分组与观察指标

　　按接种胃癌细胞的类别不同，分别取24只接种SGC7901细胞的裸鼠和24只接种MKN45细胞的裸鼠，随机平均分为3组：L组注入rhGH 0.5 U·kg-1·d-1；H组注入rhGH 2.5 U·kg-1·d-1；C组（对照组）注入0.9%NaCl，0.2 ml·d-1。均予腹壁皮下注射，自肿瘤接种后第15至第28天，共14 d，每日观察裸鼠的行动、对外界刺激的反应、皮毛色泽及摄食情况。自第12至第30天，每3 d监测裸鼠的体重和皮下移植瘤的生长情况并记录，测量肿瘤长径(A)和垂直横径(B)，按公式V＝A×B2/2计算肿瘤体积，描绘肿瘤体积增长曲线。停药2 d后，每只裸鼠摘除眼球取血约0.3 ml，后处死裸鼠，取皮下移植瘤，并仔细检查其他脏器有无转移。

　　1.3.4 血清VEGF含量检测

　　将裸鼠眼球所取血液于室温下静置2 h，待血液凝固后，以3 000 r·min-1离心10 min，提取上层血清，于-80 ℃冻存备检，以ELISA试剂盒检测各组血清中VEGF水平，方法参照说明书。

　　1.4 统计学处理
　　
　　用SPSS 13.0统计处理软件，计量数据以x-±s表示，不同组间样本均数比较采用单因素方差分析，配对设计的样本均数比较用两因素方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。
　　
　　2 结果
　　
　　2.1 胃癌细胞株GHR表达情况
　　
　　SGC7901细胞染为棕黄色，主要为细胞膜、细胞质着色，阳性细胞数约83％，GHR呈强阳性表达；MKN45细胞胞质内无明显染色，阳性细胞计数小于5％，GHR为阴性（图1，见封三）。本实验以SGC7901和MKN45细胞作为GHR阳性和GHR阴性表达细胞株进行研究。

　　2.2 肿瘤体积和体重变化
　　
　　见图2。
　　
　　接种GHR阳性和阴性表达细胞株的裸鼠第15天起予以rhGH药物干预。给药前3 d，GHR阳性和阴性表达的3组裸鼠之间体质量和肿瘤体积变化差异无统计学意义(P&>0.05)，予以rhGH的裸鼠活动状态和进食量好于对照组。给药后第3天起(接种后第18天)，GHR阳性表达的裸鼠中L组、H组与对照组相比，皮下移植瘤体积增加明显(P&<0.05)，L组与H组间比较差异也有统计学意义(P&<0.05)；3组间裸鼠体重差异无统计学意义(P&>0.05)。GHR阴性表达的裸鼠中L组、H组与对照组之间比较肿瘤体积差异无统计学意义(P&>0.05)，给予rhGH干预组裸鼠的体重均较对照组增加(P&<0.05)，H组增幅明显大于L组(P&<0.05)。随着肿瘤体积的增大，给药的后半程，GHR阳性与阴性表达裸鼠体重增长速度均较前半程减缓。实验结束处死动物，各组裸鼠肝脏、肺脏、胸腹腔均未见转移病灶。
　　
　　2.3 血清VEGF水平
　　
　　GHR阳性表达裸鼠中，对照组血清VEGF水平为(49.94±5.73) pg·ml-1，L组为(167.60±9.54) pg·ml-1，H组为(252.94±15.32) pg·ml-1，3组间差异有统计学意义(P&<0.05)。GHR阴性表达裸鼠中，对照组、L组和H组血清VEGF表达分别为(55.53±5.32) pg·ml-1、(57.33±7.35) pg·ml-1和(58.96±8.57) pg·ml-1，3组间差异无统计学意义(P&>0.05)(图3)。

　　3 讨论
　　
　　rhGH具有直接的代谢调理作用，已作为一种促合成代谢药物广泛应用于非肿瘤患者蛋白热卡不足型营养不良的治疗，可纠正手术及创伤后的负氮平衡状态，能显著改善患者的营养状况，促进胃肠道管壁细胞增殖和修复。上消化道恶性肿瘤患者常发生恶液质，癌性恶液质的发生与肿瘤对氮的过量摄取密切相关，而肿瘤患者需氮量可超过非肿瘤患者的50％～100％。给予单纯的肠内、肠外营养支持治疗并不能显著逆转恶性肿瘤患者的高分解代谢状态，因此，许多学者试图通过应用rhGH的代谢调理和免疫调节作用来纠正负氮平衡，增强机体抵抗力，从而提高抗肿瘤治疗疗效，延长生存期。然而考虑到rhGH的间接促细胞生长增殖效应，大剂量使用是否会促进肿瘤的生长，复发和转移，临床研究资料仍存在分歧［4-6］。
　　
　　肿瘤血管生成是肿瘤生长、侵袭和转移的的重要条件。肿瘤通过血管从宿主获得丰富的营养，并依赖它向宿主输出大量恶性细胞，导致肿瘤不断生长和转移，形成一个促血管生成循环［7-8］。肿瘤的血管生成与多种生长因子的刺激有关，其中VEGF是最主要、最直接的血管生长因子之一，VEGF的表达水平与肿瘤浸润深度及有无转移呈正相关［9］。
　　
　　鉴于GHR是GH发挥作用的生理基础，体外实验研究结果显示，rhGH对GHR阳性表达的肝癌细胞具有明显促增殖作用，但对于GHR阴性表达的肝癌细胞，由于缺少结合位点，不存在rhGH发挥生物学效应的生理基础，故未发现rhGH有促其增殖的作用［10-12］。
　　
　　本实验通过免疫细胞化学染色挑选出GHR阳性表达的SGC7901胃癌细胞株和GHR阴性表达的MKN45胃癌细胞株，构建了不同GHR表达状态的皮下移植瘤模型，在裸鼠体内观察rhGH对肿瘤生长、营养状况改善和VEGF表达的影响，结果发现在给药初期，rhGH治疗组的所有裸鼠，活动状态及饮水进食量均较对照组为佳。说明rhGH确实能够在一定程度上改善机体代谢状态。但不同剂量的rhGH对不同GHR表达的裸鼠体重和皮下移植瘤大小的影响存在差异。对于GHR阳性表达的裸鼠，高、低剂量rhGH组的肿瘤生长速率明显快于对照组，肿瘤体积大，说明rhGH对GHR阳性表达的肿瘤有较明显的促生长作用，且高剂量组的促生长效应更显著；但三组裸鼠体重数值相差无几，且在给药的后半程，rhGH治疗组的裸鼠体重随着肿瘤体积的逐步增大，增长速度逐渐减缓，最后高剂量rhGH组裸鼠体重甚至低于低剂量rhGH组，可能与肿瘤增长过快增加了机体的消耗有关。对于GHR阴性表达的裸鼠，rhGH治疗组和对照组肿瘤体积差异不显著，主要是由于缺少GH作用于肿瘤组织的靶点；而其他正常组织部位广泛分布有GHR，rhGH促体重增长的效应得以体现，这与以往的研究结论相一致［2］。进一步研究提示rhGH诱导VEGF分泌可能是通过GHR发挥生物学效应［13］。
　　
　　临床研究发现［14］，在肿瘤患者的血清及癌组织中VEGF的表达水平均异常增高，且两者中VEGF变化具有高度一致性，显示两者存在正相关性，可以用血清VEGF水平来判断癌组织中VEGF的表达情况，借此反映肿瘤血管的生长状态，并且血清检测方法具有微创、操作简便且能反复进行等特点。有利于肿瘤临床监测和治疗。本实验中同样发现，肿瘤不断生长分泌的VEGF不仅仅局限于肿瘤组织本身，大量的VEGF释放入外周血，血清中也可以检测到高水平的VEGF，且这种促VEGF表达的作用在GHR阳性表达的裸鼠中表现更为明显，推测，GHR的存在极可能是rhGH影响VEGF分泌的关键靶点之一。
　　
　　由于肿瘤本身GHR表达量的不同，rhGH对肿瘤生长的影响不可一概而论：对于GHR阴性表达的肿瘤，缺少rhGH结合位点，没有显著的促肿瘤生长效应；对于GHR阳性表达的肿瘤，除肿瘤体积增大外，还可促进VEGF表达增多，存在促肿瘤生长及血行转移的风险，临床上使用需谨慎。可以在手术切除原发肿瘤后，尽量短期、或同时与化疗、抗血管生成治疗联合使用。关于GH与GHR结合后的信号转导通路以及促VEGF分泌的具体机制仍有待进一步研究。

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