基于HEV中和表位的基因免疫诱导特异性抗体及中和作用研究

　　　　 作者：王春玲，杨书才，孟继鸿，王立新

【摘要】 　　目的：观察基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因免疫是否能在小鼠体内诱导具有中和作用的抗体应答。方法：构建含HEV中和表位p179编码基因的真核表达质粒pVAX179，以肌肉注射法对BALB/c小鼠实施基因免疫，实验组每只小鼠给pVAX179 100 μg，并设立空质粒pVAX和HEVp179蛋白两个对照组。定期采集小鼠血清，ELISA法检测其特异性抗HEVIgG抗体及其亲合力；以基于PCR的体外中和实验检测抗体的中和活性。结果：pVAX179质粒基因免疫诱导小鼠体内产生了特异性抗HEVIgG抗体，抗体水平于第10周达高峰，OD值为0.55±0.13，与空质粒pVAX组(0.15±0.07)比较差异有统计学意义(P＜0.001)。第6周实验组抗体亲合力(ED50为2.5 mol·L-1)高于蛋白对照组（ED50为2.0 mol·L-1)，基因免疫促进了抗体亲合力的成熟；体外中和实验证实产生的特异性抗体能够阻止HEV感染人肝癌细胞7721，具有中和HEV的活性。结论：基于戊型肝炎病毒中和表位(p179)的基因疫苗pVAX179能够在小鼠体内诱导产生具有中和作用的抗体应答。

【关键词】 戊型肝炎病毒； 中和表位； 基因疫苗； 抗体应答； 中和作用

　　［Abstract］ Objective：To investigate whether the DNA vaccine based on HEV neutralization epitope(s) HEVp179 could induce neutralizing antibody response in mice.Methods：The neutralization epitope(s) HEVp179coding gene was subcloned into a eukaryotic expression vector pVAX to construct recombinant plasmid pVAX179. BALB/c mice were immunized i.m. with 100 μg DNA of pVAXp179 plasmid， mock DNA，and 1 μg protein of HEVp179，respectively.Sera collected at the indicated times from two groups were determined the levels and avidity of specific antiHEV IgG antibody by ELISA.The neutralizing activity of induced antiHEV antibody was detected in a PCRbased cell culture neutralization assay.Results:Immunizations with pVAX179 successfully induced antiHEV specific antibody response and accelerated the avidity maturation of antibodies.The antiHEV level reached the hightest values about 10 weeks after first vaccination.The avidity of antibodies from pVAX179 immunized mice was higher than that from HEVp179 protein immunized group.In addition，the postimmune sera obtained from pVAXp179 vaccinated mice were found the protective neutralizing activity against HEV infection.Conclusion：These results indicate that the DNA vaccine based on HEV neutralization epitope(s)HEVp179 could induce neutralizing antibody response against HEV in mice．

　　［Key word］ hepatitis E virus； neutralization epitope； DNA vaccine； antibody response； neutralizing activity
　　
　　戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是无包膜的单正链RNA病毒，主要通过胃肠道传播，是引发急性戊型肝炎(hepatitis E，HE)的病原体。目前HE尚无特效的抗病毒治疗药物，因此，HEV疫苗的研制受到人们的重视。HEV疫苗的关键是能否诱导具有保护作用的中和抗体［1-2］，而中和抗体的诱导必须基于中和抗原表位。
　　
　　在以往的研究中我们发现，来源于HEVORF2编码衣壳蛋白C端(第439～617位氨基酸)的p179多肽是能在真核细胞有效表达的、含有中和抗原表位的最短多肽［4］，这为研制基于中和表位的HEV基因疫苗奠定了物质基础。
　　
　　在本研究中，我们以pVAX为真核表达载体、HEVORF2439～617(p179)为靶基因构建重组质粒pVAX179，以肌肉注射法对Balb/c小鼠实施基因免疫，观察该基因疫苗在小鼠体内诱导的HEV特异性抗体及其中和作用。
　　
　　1 材料与方法
　　
　　1.1 质粒和主要试剂
　　
　　真核表达载体pVAX由复旦大学熊思东教授惠赠，PCR产物纯化试剂盒Plasmid Mega Kit购自QIAGEN公司，纯化HEVp166［3］、HEVp179蛋白由本室自制，HRP标记羊抗小鼠IgG抗体购自Sigma公司，0.75%布比卡因和戊巴比妥钠购自上海禾丰制药有限公司，硫氰酸钠购自Sigma公司，大肠杆菌DH5α为本室保存。
　　
　　1.2 重组质粒pVAX179的构建、鉴定及大量纯化
　　
　　以PCR法获得HEVp179编码基因，经NheⅠ和BamHⅠ双酶切后与酶切空载体pVAX进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，挑取转化菌落进行PCR筛选，阳性克隆进行DNA测序。大量纯化质粒DNA，微量紫外分光光度仪检测DNA浓度，并用生理盐水将浓度调整至1 μg·μl-1。
　　
　　1.3 重组质粒pVAX179的体外表达
　　
　　在Nerk细胞小室内接种HepG2人肝癌细胞，24 h后待其长到80%底面积时，采用脂质体Lipofectamine2000方法［4］转染真核表达质粒pVAX、pVAX179，浓度为1 μg·μl-1。培养48 h后采用间接免疫荧光法检测目的抗原在细胞内的表达，方法如下：0.01 mol·L-1PBS(pH 7.4)洗细胞3次，4%多聚甲醛室温固定10 min后室温吹干；0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)洗细胞3次，以含5％BSA的TBST 37 ℃封闭40 min；用5％BSA的TBST稀释抗HEV单克隆抗体(1 ∶1 000)，37 ℃作用60 min；0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)洗细胞3次，5％BSA TBST稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG抗体37 ℃作用60 min；0.01 mol·L-1 PBS(pH 7.4)洗细胞3次，50%甘油的PBS封片，荧光显微镜下观察。
　　
　　1.4 实验动物和基因免疫
　　
　　6～8周龄、16～18 g体重的雌性BALB/c小鼠(H2d)，购自复旦大学实验动物科学部。以免疫pVAX179重组质粒为实验组、空质粒pVAX和HEVp179蛋白为对照组，每组均为6只，肌肉注射法实施基因免疫，免疫剂量均为每只小鼠100 μg DNA(蛋白对照组每只小鼠1 μg HEVp179蛋白)，于第2、4周各加强免疫1次，共免疫3次。定期采集小鼠血清，-20 ℃保存待检。
　　
　　1.5 免疫小鼠血清特异性抗HEVIgG抗体及其亲合力的检测

　　采用常规ELISA法，以纯化HEVp166蛋白(1 μg·ml-1)包被96孔酶标反应板(100 μl·孔-1)，以HRP标记的羊抗小鼠IgG作为第二抗体，酶标仪测得各孔A490 nm值表示抗体水平。采用硫氰酸钠（NaSCN）竞争ELISA实验测定特异性抗体的亲合力，结果以ED50值表示。以HEVp166蛋白1 μg·ml-1(100 μl·孔-1)包被96孔酶标反应板，置湿盒中，37 ℃放置1 h后4 ℃过夜，用0.05%PBST洗涤3次，每次30 s，以含5%山羊血清和5%小牛血清白蛋白的PBST 37 ℃封闭1 h，洗涤3次；小鼠血清作1∶10稀释后加入各孔，37 ℃温育1 h；用0.05%PBST洗涤3次，然后于同一血清标本的各孔中加入100 μl不同浓度的NaSCN(0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 mol·L-1，用PBS稀释)，室温静置25 min，然后用PBST洗涤3次；加含30％小牛血清PBST稀释的HRP标记羊抗小鼠IgG抗体，37 ℃ 1 h，PBST洗涤6次；OPD显色，2 mol·L-1 h3SO4终止反应，酶标仪检测A490 nm值。
　　
　　1.6 免疫小鼠血清特异性抗HEVIgG抗体体外中和作用的检测

　　以RTPCR法确定HEV体外感染人肝癌细胞的最低感染滴度后，取100倍的HEV最低感染滴度的病毒稀释液作为中和实验中的病毒使用量，然后将免疫后第8周采集的pVAX179实验组、pVAX空质粒对照组(每组6只小鼠)的血清分别进行等量混合，取上述两组混合血清100 μl分别与含100倍的HEV最低感染滴度的病毒粪便滤液100 μl混合(按1 ∶1的稀释度)，于37 ℃孵育1 h。接种单层7721细胞，于37 ℃继续孵育2 h，洗涤3次，按常规方法抽提核酸，采用RTnPCR检测HEV RNA。同时，以10-1病毒感染的7721细胞和10倍稀释的免疫前的小鼠血清作为阴性对照，以未感染HEV病毒的7721细胞和具有中和作用的抗HEVIgG单克隆抗体5G5作为阳性对照。结果判定：以PCR检测呈阴性者为中和抗体阳性。
　　
　　1.7 统计学处理
　　
　　实验数据采用SPSS软件处理，结果采用t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。

　　2 结果
　　
　　2.1 重组质粒pVAX179的鉴定
　　
　　菌落PCR筛选结果显示：PCR呈阳性克隆菌1号菌落，其扩增产物的大小与理论值(549 bp)吻合(图1A)。小量抽提1号克隆的质粒进行DNA序列测定，结果表明：HEV179编码基因的序列正确，读码框架准确(图1B)。
　　
　　2.2 重组质粒pVAX179体外表达的检测
　　
　　转染pVAX179质粒的HepG2细胞在荧光激发下呈现强烈的黄绿荧光，而转染pVAX空质粒的HepG2A.菌落PCR鉴定转化克隆［1.1号克隆；2.2号克隆;3.DNA Marker(100 bp)］；B.1号克隆的DNA序列测定细胞未见荧光（图2，见封三）。提示pVAX179重组质粒能够在真核细胞有效表达目的蛋白p179。
　　
　　2.3 pVAX179基因免疫诱导HEV特异性抗体应答及其亲合力的检测

　　由图3A可见：pVAX179重组质粒3次免疫后诱导机体产生了特异性抗HEVIgG抗体，并于第10周抗体水平达高峰，与空质粒pVAX免疫组比较差异有统计学意义(A490nm值：pVAX179组=0.55±0.13，pVAX组=0.15±0.07，P＜0.001)。提示基于中和表位p179的基因免疫能成功诱导小鼠产生特异性的抗体应答。
　　
　　随后，采取100倍的HEV最低感染滴度的病毒稀释度，即10-1稀释度病毒作为中和试验中的病毒使用量，进行基于PCR的体外中和试验，检测pVAX179基因免疫诱导抗体的中和活性。如图4B显示：pVAX179基因免疫诱导产生的特异性抗体能够在体外中和HEV病毒，阻止病毒感染7721细胞。提示基于中和抗原表位p179的基因疫苗所诱导产生的特异性IgG抗体具有保护性中和作用。

　　3 讨论
　　
　　HEV基因疫苗大多以ORF2或ORF3全基因序列为基础，能诱导产生一定水平的具有保护作用的IgG抗体［6］。近几年来，随着对抗原蛋白的一级结构与空间结构的深入研究，人们逐渐认识到全蛋白基因中含有多种抗原表位(包括中和表位和非中和表位)及其他调控序列、免疫抑制序列，而其他无关成分的存在会影响目的抗原表位的免疫优势地位，因此，基因免疫由最初的基于抗原全基因表达载体阶段，发展到了基于抗原表位的表达载体阶段。HEVORF2和ORF3存在多个抗原表位以及中和性抗原表位［6-8］。本室先前证实的p179是能在真核细胞有效表达的、最短的、含中和抗原表位的多肽(位于ORF2编码蛋白第439～617位氨基酸)，这为研制基于中和表位的HEV基因疫苗奠定了物质基础。
　　
　　pVAX质粒是美国FDA首次批准能用于人体实验的真核表达载体，以该质粒作为本项目的载体为日后的实际应用提供便利，一旦实验成功可直接进入人体实验，不必更换表达系统。在本研究中，我们将HEVORF2439～617(p179)编码基因克隆入pVAX质粒以构建p179真核表达载体，经过PCR、DNA序列分析等确证，我们成功构建了pVAX179重组质粒。随后以间接免疫荧光法检测证实，pVAX179能够在体外真核细胞中有效表达目的蛋白p179。以肌肉注射法对Balb/c小鼠实施基因免疫，结果发现，基于HEV中和表位p179的基因免疫能成功地在小鼠体内诱导产生抗HEV特异性的体液免疫应答，产生了HEV特异性IgG抗体。
　　
　　抗体的亲和力与其中和、清除病毒的活性密切相关，也是评价基因免疫效果的重要指标。本实验中，我们采用NaSCN竞争ELISA实验检测并比较了pVAX179基因免疫和重组蛋白p179免疫诱导抗体的亲合力，结果发现，基因疫苗pVAX179诱导产生的特异性抗体亲合力较蛋白免疫组强，显示了基因疫苗pVAX179诱导的抗体亲和力成熟。Boyle等［9］也在以模式抗原为靶抗原的基因免疫研究中发现，以DNA免疫的方式诱导机体产生的特异性抗体亲和力较蛋白免疫组强。其主要原因可能是基因免疫小鼠在免疫局部能持续地表达低水平靶抗原，形成的抗原抗体复合物被输送到淋巴滤泡，并定位于FDC表面，表达高亲和力BCR的B细胞与抗原抗体复合物中的抗原结合，并在抗原特异性的Th细胞辅助下增殖，产生高亲和力的抗体。
　　
　　HEV基因疫苗的核心问题是基因免疫诱导产生的抗体是否对病毒感染具有中和作用。但是由于灵长类动物模型价格昂贵、使用不便，HEV体外感染细胞尚未成功等原因，致使抗HEV中和抗体及其保护作用的检测难以深入。本研究中，我们采用基于PCR的体外中和实验检测了pVAX179基因免疫诱导抗体的中和活性［3］，结果显示，pVAX179基因免疫诱导产生的特异性抗体能够在体外中和HEV病毒，阻止病毒感染人肝癌细胞7721，PCR检测呈阴性。推测基于中和抗原表位的基因疫苗pVAX179诱导机体产生了具有保护性中和作用的抗体应答。同时，我们也注意到：与蛋白免疫相比较，pVAX179诱导的抗体应答水平仍然很低，在今后的研究中有必要进一步分析pVAX179基因免疫诱导的免疫应答的类型，使用各种有效的免疫增强策略，进一步提高基因免疫诱导的特异性体液免疫应答水平。
　　
　　总之，在本研究中我们首次以含HEV中和抗原表位的最小多肽片段p179编码基因的重组质粒实施基因免疫，成功诱导了具有中和作用的HEV特异性抗体应答，为下一步研究HEV基因免疫提供了新的思路和方向。

参考文献

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