兔退变椎间盘模型中髓核细胞凋亡的实验研究

　　　　 作者：樊守刚，吴小涛，王运涛，李果

【摘要】 目的：研究细胞凋亡在兔退变椎间盘模型中的作用。方法：用针刺法制作兔退变椎间盘模型，磁共振检查鉴定模型的建立，HE染色计数髓核细胞，TUNEL法染色标记凋亡髓核细胞，并通过激光共聚焦显微镜计数凋亡细胞比例，RTPCR检测Bax和Bcl2凋亡相关基因的表达水平。结果：兔退变模型建立成功，退变组髓核细胞计数低于正常组，凋亡细胞比例高于正常组，退变组抗凋亡基因表达低于正常组，凋亡基因水平高于正常组。结论：凋亡在椎间盘退变模型中存在，并起重要作用。

【关键词】 椎间盘退变; 退变模型; 凋亡; 激光共聚焦显微镜; 兔

　　[Abstract] Objective: To study the effect of nucleus pulposus cells apoptosis on the rabbit intevertebral disc model. Methods: Rabbit models of degenerated intevertebral disc were established by anulus puncturing， which were then identificated by MRI. Nucleus pulposus cells were counted using HE staining; the proportion of apoptotic cells was counted by laser scanning confocal microscope with TUNEL staining marked apoptosis of nucleus pulposus cells; and RTPCR were used in detection of Bax and Bcl2 levels as apoptosisrelated genes. Results: Compared with the normal group，the amounts of nucleus pulposus cells were lower and the proportion of apoptotic cells was higher in degeneration group. The level of antiapoptosis gene expression was lower and the level of apoptosis gene expression was higher in degeneration group than those in normal group.Conclusion: The apoptosis in the degenerated intervertebral disc models exists and plays an important role.

　　[Key words] intervertebral disc degeneration; degeneration model; apoptosis; laser confocal scanning microscope; rabbits

　　腰椎退变性疾病是临床引起腰腿痛的主要病因，但椎间盘退变的病理机制目前并未完全清楚，年纪的增长、血管难长入、终板的病变导致椎间盘缺少营养、细胞的凋亡、胶原的变化、椎间盘机械负荷及蛋白多糖的变化等都被认为是导致椎间盘退变的病因。研究认为髓核细胞凋亡参与退变过程并在此过程中起关键作用[1]。本实验通过针刺法制作兔退变椎间盘模型，通过模型研究椎间盘退变中凋亡的发生与发展规律。

　　 1 材料和方法

　　1.1 材料

　　新西兰大白兔(南京农业科学院种兔厂);激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP5，德国)，7.0TmicroMRI(Bruker公司，德国);恒温箱冷冻切片机(MICIROM325，德国);TaKaRa LA PCRTM KitVer.2.1试剂盒(大连宝生物工程有限公司);Trozol(Invitrogen公司，美国);红色荧光标记的TUNEL法凋亡检测试剂盒(In Situ Cell Death TMR red，roche，瑞士);Bax和Bcl2引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成：Bax(225 bp)上游为5′CCGTGACCATCTTTGTGGC3′，下游为5′TGTCCCGAAGGAGGTTTATT3′;Bcl2(452 bp)上游为5′GGGAGAACAGGGTACGATAA3′，下游为5′CCACCGAACTCAAAGAAGG3′;βactin(155 bp)上游为5′TATGACTTAGTTGCGTTACACC3′，下游为5′CCTTCACCGTTCCAGTTT3′。

　　1.2 方法

　　1.2.1 兔腰椎间盘退变模型的构建 纯种成年新西兰大白兔32只，雌雄不限，平均质量2.5 kg，采用随机排列数方法分为正常组和退变组各16只，退变组采用侧方倒八字入路对L4-5节段椎间盘行针刺法造模[2]，术中暴露相应节段椎间盘后于椎间盘前方和左右侧方各用21号针头等深针刺5次(图1)，逐层缝合切口后继续饲养。

　　图1 手术路径(左图暴露椎间盘视野，右图为针刺法造模)

　　Fig 1 Operative approach(Left. Exposure of the visual field; Right. Method of acupuncture)

　　1.2.2 MRI检测 造模后第8周耳缘静脉注射空气处死两组兔后取出相应节段脊柱，采用7.0 T microMRI检测鉴定退变模型。水平扫描架内径16 cm，采用61 mm大鼠体部射频线圈。脊柱标本取出后置于扫描架内。扫描序列采用TurboRACE T2WΙ序列。TurboRACE T2WΙ序列主要扫描参数为：TR 4 200 ms，TE 36 ms，层厚1 mm，层间距0.5 mm，FOV 60 mm×40 mm，矩阵256×256，反转角(FA)180°，重复次数1次，空间最小分辨率约为234 μm×156 μm/像素，扫描时间约为80 s。数据后处理采用Image J软件，分别测量各兔正常组和退变组椎间盘髓核组织5个层面的平均信号强度及背景噪声，计算各组间的信号噪声比(signalnoise ratio，SNR)，同时测量各个层面椎间盘平均高度值(最高值和椎体前、后缘三点平均值)，评估各组椎间盘退变水平。

　　1.2.3 透射电镜标本的制作和观察 退变手术后4周时，取相应节段新鲜椎间盘的髓核组织，切取1 mm×1 mm×1 mm大小标本，加入4%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，梯度乙醇脱水，Epon812环氧树脂包埋，半薄切片定位，LKBV超薄切片机超薄切片，铀铅复染，JEM2000EX透射电镜(JEOL公司，美国)下观察。

　　1.2.4 冰冻切片制作 造模手术后第8周抽取两组新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气10 ml致死，迅速取相应节段椎间盘，标本离体后立即行O.C.T.包埋，置于液氮罐(-190 ℃)中冰冻保存，用恒温箱冷冻切片机制作6 μm冰冻切片。每个椎间盘标本分别取不同层次3张切片。

　　1.2.5 HE染色计数髓核细胞 冰冻切片制作成功后，常规固定，吹干后行HE染色，光镜下计数髓核细胞，每个切片计数2个视野。

　　1.2.6 激光共聚焦显微镜检测细胞凋亡比率 按原位细胞凋亡检测试剂盒说明书步骤，切片于冰上经渗透液(0.1%Triton X100)孵育2 min后，在黑暗的湿盒中用染色混合液37 ℃孵育1 h，DAPI染色液孵育5 min，期间常规漂洗，行抗荧光淬灭剂处理后封片。阳性对照用凋亡诱导剂(核酸酶)处理，阴性对照不加末端脱氧核糖核酸转移酶。采用激光共聚焦显微镜进行观察荧光染色的切片并行定量分析，每张切片在200×视野下找5个视野观测。激光共聚焦显微镜观测时波长设置如下：观察DAPI核染细胞激发波长405 nm，发射波长454 nm;观察TUNEL阳性细胞激发波长543 nm，发射波长620 nm，采用Leica TCS SP5系统工具融合图像。分别计数两组髓核细胞凋亡率，髓核细胞凋亡率=凋亡髓核细胞(DAPI和TUNEL共显，蓝红色细胞)/所有髓核细胞(DAPI显色，蓝色细胞)

　　1.2.7 半定量RTPCR检测Bax和Bcl2基因表达 取各实验组整个椎间盘标本髓核组织，采用Trizol法提取总RNA。按试剂盒说明书进行操作，细胞总RNA反应量均为2 μg，总反应体积为25 μl。逆转录反应条件：42　 ℃　30　min，99　℃　5　min，5　℃　 5　min。PCR体系总体积为20　μl，反应条件：94　℃预变性5　min;94　℃变性30 s，50 ℃退火30 min(Bax和Bcl2基因分别为54 ℃和59 ℃退火30 s)，72 ℃延伸1 min，30个循环;72 ℃延伸7 min。选取5 μl PCR产物，经2%琼脂糖凝胶电泳40 min，溴化乙锭染色，用Image Master VDS图像分析处理系统扫描，以Bax/βactin cDNA以及Bcl2/βactin cDNA光密度比值作为Bax mRNA和Bcl2 mRNA的相对表达水平。

　　1.3 统计学处理

　　实验所测得各组数据均用±s表示;样本均数间的比较采用独立样本t检验，P&<0.05为差异有统计学意义。采用SPSS 11.5统计学软件进行分析。

　　2 结 果

　　2.1 退变模型的检测

　　造模2周后对退变椎间盘的MRI检测，T2像上退变组与正常组相比，椎间盘高度减低(高度分别为101.04±3.51和77.67±4.13，P=0.007)，平均信噪比减低[信噪比分别为(43.40±1.68)%和(19.92±1.82)%，P&<0.001](图2)。

　　2.2 凋亡髓核细胞形态观察

　　透射电镜观察退变组和正常组髓核组织，各标本均能找到1～3个凋亡细胞(图3)，表现为细胞核染色质固缩，集聚至核周边呈月牙型斑块;胞浆浓缩;与胞膜融合形成膜表面泡状突起;受损细胞体积缩小，与临近正常细胞脱离，细胞膜内陷形成凋亡小体。

　　2.3 细胞计数与凋亡细胞比例

　　HE染色计数髓核细胞，退变组髓核细胞数少于正常组(细胞计数分别为81.65±13.26和111.45±25.42，P&<0.001)(图4)。冰冻切片经TUNEL法染色后，激光共聚焦显微镜下所有髓核细胞均被蓝染(DAPI)，凋亡阳性细胞呈红染，各个椎间盘均有凋亡阳性染色，退变组细胞凋亡率高于正常组(细胞凋亡率分别为15.31±2.07%和7.51±4.89%，P&<0.001)(图略)。

　　2.4 凋亡基因检测

　　通过RTPCR检测比较各组髓核组织中细胞凋亡相关基因Bax和Bcl2 mRNA的表达，正常组的抗凋亡基因Bcl2 mRNA表达水平高于退变组(灰度值分别为1.140±0.053和0.883±0.092，P&<0.05)，而Bax mRNA的表达高于正常组(灰度值分别为0.793±0.069和0.426±0.052，P&<0.05)(图5)。

　　3 讨 论

　　椎间盘退变是人体随着年龄的增长，椎间盘内髓核组织的营养供应不足，髓核退变后脱出，压迫周围组织，从而引起临床上椎间盘突出、椎管狭窄、退变性脊柱滑脱等疾病。椎间盘退变的病因学研究中，细胞凋亡的作用越来越引起人们的重视[3]。Fas/FasL、caspase族等蛋白分子是在凋亡信号传导和凋亡执行过程中的主要分子，Bax、Bcl2、转化生长因子和胰岛素样生长因子等是调节这些分子表达及调节凋亡的重要因子，其中Bcl2基因家族及其相关蛋白Bcl2是研究最早的与凋亡有关的分子，Bcl2基因家族也是目前最受重视的调控细胞凋亡的基因家族。Bax和Bcl2通过形成同源或异源二聚体来调节细胞凋亡：当Bax形成同源二聚体时诱导细胞凋亡;Bax与Bcl2形成异源二聚体时则实现了Bcl2抑制细胞凋亡的功能。本实验采用针刺法成功制作兔椎间盘退变模型，与正常组椎间盘相比，退变组Bax表达上调，Bcl2表达减低，细胞凋亡率增高，总细胞计数减少，相应椎间盘MRI检测示椎间盘退行性改变。研究显示，凋亡参与退变过程并在此过程中起关键作用。抑制凋亡可能成为将来椎间盘退变性疾病的治疗方法之一[4]。

　　7.0 T高场强动物磁共振扫描仪(德国Bruker公司)的空间解析率可达100 μm，梯度磁场强度为300 mT·m-1，其高空间分辨率和高场强使其图像能够清晰地反映兔椎间盘解剖结构及捕捉细微的信号改变[5]。本实验采用7.0 T microMRI检测鉴定兔退变椎间盘模型，T2像上退变组椎间盘呈现为椎间盘高度减低和平均信噪比减低，验证方法准确可靠。

　　实验动物模型是科学实验用以研究疾病的重要手段，兔模型是椎间盘退变常用的实验模型，Kim等[2]通过实验证实针刺法制作兔退变模型方法，优于髓核抽吸法和注射凋亡诱导剂法。本实验通过7.0 T MRI证实，针刺法能有效制作椎间盘退变模型;手术4周后椎间盘明显显示出高度减低、信噪比降低、髓核细胞凋亡基因表达上调、抗凋亡基因表达下调、细胞凋亡率升高和总细胞数减低等退变表现。该造模法不直接操作于髓核，保留髓核原内环境状态，可作为研究椎间盘退变后髓核细胞的各种变化规律的可靠模型制作方法。

　　本实验从建立动物模型角度，验证细胞凋亡参与椎间盘退变，并从基因水平证实其在退变发生发展中的重要作用;但凋亡发生的始动因素、凋亡过程中具体分子作用机制及抑制凋亡能否有效抑制椎间盘退变等相关机制，尚有待进一步实验证实。

参考文献

　[1] 王栋琪，刘淼，宋焕瑾，等.人退变腰椎间盘中细胞凋亡与Bax及半胱胺酸蛋白酶蛋白3基因的表达[J].中国修复重建外科杂志，2008，22(4):421425.

　　[2] KIM K S， YOON S T， LI J， et al. Disc degeneration in the rabbit: a biochemical and radiological comparison between four disc injury models [J]. Spine(Phila Pa 1976)， 2005，30(1):3337.

　　[3] ZHAO C Q， JIANG L S， DAI L Y. Programmed cell death in intervertebral disc degeneration [J]. Apoptosis， 2006，11(12):20792088.

　　[4] ZHAO C Q， LIU D， LI H，et al. Interleukin1 beta enhances the effect of serum deprivation on rat annular cell apoptosis [J]. Apoptosis， 2007，12(12):21552161.

　　[5] 周智洋，单鸿，邹学农，等.7.0T磁共振关节软骨T2弛豫时间图与量化分析的实验研究[J].中国医学影像技术，2008，24(2):171175.