【摘要】 目的： 通过制备As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒来研究热化疗对乳腺癌的治疗效果。方法： 采用改良的化学沉淀浸渍法制备As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，通过透射电镜、扫描电镜、能谱仪、原子荧光光谱仪来表征;检测As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的释药水平及在交变磁场中的升温能力;通过MTT比色法和流式细胞仪检测化疗组、热疗组及热化疗组乳腺癌的治疗效果。结果： 制备的复合纳米粒粒径为20～40nm;复合纳米粒体外升温能达到肿瘤的有效治疗温度(41～46 ℃);释药缓慢，48 h释药为14.67%。结论： 采用改良的化学沉淀浸渍法可以成功制备As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，体外实验证明该复合纳米粒联合交变磁场热疗对乳腺癌细胞具有很强的生长抑制和凋亡诱导作用。
【关键词】 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4; 纳米; 热化疗; 乳腺癌
恶性肿瘤的诊断和治疗一直是医学领域试图攻克的难题，随着医学水平的发展，人们对肿瘤治疗新型方法的研究已经向分子和原子水平迈进。1996年，德国学者Jordan等[1] 发现纳米级磁微粒比微米级微粒能产生更多的热量，提出了磁流体热疗(magnetic fluid hyperthermia， MFH)新技术。本实验采用改良的化学沉淀浸渍法制备了As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，将具有广谱抗癌性的As2O3和磁流体(锰锌铁氧体)热疗结合起来，对乳腺癌MDAMB231细胞株进行热化疗的体外实验研究。
1 试剂和仪器
As2O3、二甲基亚砜(DMSO， Sigma公司);HEPES、胰酶、噻唑蓝(Amresco);硫酸锰、硫酸锌和硫酸亚铁等均为分析纯;DMEM(Gibco Brl， 美国);胎牛血清(杭州四季青生物工程公司);能谱仪(Noran， Vantage，美国);H600透射电镜(Hitachi，日本);扫描电镜(JEOLJSM6360LV，日本);酶标仪(美国BD公司);流式细胞仪(FACS Vantage SE， BectonDickson，美国);原子荧光光谱仪(北京瑞利分析仪器公司); MDAMB231(购自中国科学院上海细胞研究所)。
2 方 法
2.1 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的制备
采用改良的化学沉淀-浸渍法制备复合纳米粒，按Mn2+、Zn2+、Fe2+摩尔比1∶1∶4准确称量适量MnSO4·h3O、ZnSO4·7h3O和FeSO4·7h3O33种硫酸盐，研成粉末后将适量NaOH溶液加入其中，磁力搅拌器高速搅拌3 h后放入80 ℃烤箱干燥，马弗炉400 ℃焙烧1 h，自然冷却后用热蒸馏水浸洗去除可溶性硫酸钠无机盐，烘干成锰锌铁氧体粉末，配制亚砷酸溶液使As2O3浓度为0.01 mg·ml-1、0.02 mg·ml-1、0.03 mg·ml-1、0.04 mg·ml-1，称取适量锰锌铁氧体粉末浸渍于其中，离心烤干。
2.2 As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒的表征
2.2.1 形态观察 取出少量制备的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，加入无水乙醇超声分散20min后滴铜网，在透射电镜下观察形态，取少量粉末在扫描电镜下观察。
2.2.2 能谱仪测定复合纳米粒的成分 扫描电镜下对制备的复合纳米粒成分进行能谱分析，确定其元素组成成分。
2.2.3 磁响应性检测 用适量生理盐水将复合纳米粒配成混悬液，在烧杯下放置一磁铁观察磁性材料聚集情况。
2.2.4 含砷量测定 用原子荧光光谱仪测定其含砷量。
2.3 升温试验
将复合纳米粒用生理盐水配成6、8、10、12 g·L-1的磁流体，置于频率为200 kHz、输出电流300 A的交变磁场下进行升温试验，每5 min记录1次温度。
2.4 释药试验
用生理盐水配成10 g·L-1的混悬液，取10 ml装于透析袋中，外面透析介质亦为生理盐水，磁力搅拌器常温搅拌5 0 h，每隔1 h取液测量释放液中As含量，绘制累积释药曲线。
2.5 细胞株和细胞培养
乳腺癌细胞株MDAMB231常规培养于含10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中。
2.6 MTT比色法检测细胞增殖抑制率
取对数生长期MDAMB231细胞，消化吹打成2.5×104 ml-1，在两块96孔培养板中每孔接种200 μl(每板两组，每组8个复孔)，置于37 ℃、5%CO2培养箱培养。24h细胞贴壁后一块培养板分别加入DMEM培养液(阴性对照组)、5 μmol·L-1As2O3溶液培养(化疗组)，另一块培养板分别加入10 g·L-1的Mn0.5Zn0.5Fe2O4培养液(热疗组)及As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒培养液(热化疗组)，置于200 kHz、4 kW、输出电流300 A的交变磁场加热1 h继续培养，48h后加入MTT20 μl，4 h后弃去液体，每孔加入150 μlDMSO，置于酶标仪上振荡混匀10 min测OD493 nm值，细胞增殖抑制率=1-实验组OD值/对照组OD值。
2.7 流式细胞术测凋亡率
按上述分组将治疗48 h后细胞制成单细胞悬液，PBS洗涤细胞两次，70%乙醇4 ℃固定细胞24 h以上。检测前用PBS洗涤细胞两次，细胞重悬于0.5 mlPI染色液(20 g·ml-1，0.25 mg·ml-1RNase A)中，室温避光染色30 min，用300目丝网过滤后即可上机分析。
3 结 果
3.1 表征
采用化学沉淀-浸渍法制备的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料为棕褐色粉末，在外磁场作用下具有良好的磁响应性，能够形成明显的磁力线。用透射电镜和扫描电镜观察，As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒近似球形，密度较高，粒径在20～40 nm(图1)，扫描电镜下任选一视野进行能谱分析，均能检测到锰、铁、锌、砷等材料成分(图2)。用原子荧光分光光度计测定的As标准工作曲线为：I=3.737+13.097C，r=0.999 5，其中I为分析信号峰面积，C为As浓度，经测定复合材料中含砷量为0.05%。
3.2 升温情况
不同浓度的As2O3/ Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒在体外交变磁场作用下具有升温能力，在前30 min升温迅速，30～45 min升温平缓，之后温度基本保持恒定不变，且10 g·L-1浓度的复合纳米粒升温能达到肿瘤治疗的有效温度(41～46℃)(图3)。
3.3 体外释药速率的动态测定结果
以生理盐水为介质考察了As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料的体外动态释放，计算其累积释放率，48 h释药为14.67%，曲线平缓(图4)。
3.4 MTT比色法检测结果
结果显示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒联合交变磁场加热组能显著抑制细胞增殖，且比单纯As2O3溶液组和Mn0.5Zn0.5Fe2O4联合交变磁场加热组的抑制作用明显(表1)。表1 As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒联合热化疗组可出现DNA含量明显低于G1期的亚G1期细胞峰，即凋亡峰(凋亡率为31.18%)，显著高于化疗组(凋亡率为7.44%)和热疗组(凋亡率为16.17%)，而阴性对照组则几乎无凋亡峰(图5)。
4 讨 论
砷及其化合物是人类最早用于治疗肿瘤的药物，目前As2O3注射液已作为国家二类新药正式上市，国内外研究其对实体瘤的作用，如乳腺癌[2] 、肺癌[3]、食管癌[4]、胃癌[5]，确认了其广谱抗癌性，其机制主要是促进肿瘤细胞分化、诱导其凋亡，多途径抑制肿瘤增殖转移且毒副作用小，对正常细胞无明显影响。而肿瘤热疗是用加热方式治疗肿瘤的一种新方法，即利用物理能量在组织中沉淀而产生热效应，使肿瘤组织温度上升到有效治疗温度(41～46 ℃)[6]以杀死癌细胞，又不损伤正常细胞的新型治疗方法，热疗不仅没有化疗及放疗的副作用，而且可以克服肿瘤细胞的耐药性，大大增强癌细胞对化疗和放疗的敏感性[7]，诱导细胞凋亡。近年来，许多研究者将砷与热疗通过不同的形式联合起来治疗恶性肿瘤，取得了显著的成果，如邢宝玲等[8]将As2O3和自行研制的纳米锰锌铁氧体磁性材料一起用脂质膜包裹起来制成As2O3磁性纳米脂质体，体外抗卵巢癌细胞实验显示，将As2O3与热疗联合起来对癌细胞的毒杀作用强于单纯的As2O3组和热疗组。倪海燕等[9]通过乳化冷冻凝聚法制备了As2O3磁性纳米微球，并通过治疗宫颈癌证明了As2O3联合热疗对肿瘤细胞的生长抑制和诱导凋亡作用明显。
本研究中通过制备As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒并作用于乳腺癌细胞，我们探讨了将As2O3的细胞毒作用同磁热疗相结合，以期寻求一个更有效地杀伤恶性肿瘤细胞的方法。As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒是采用改良的化学沉淀-浸渍法[10]制备的，这种方法的优点是合成工艺简单，成本低廉，且制备的粒径为20～40 nm，由于粒径极小，在体内不但可以逃脱MPS的捕获，而且还具有很强的吸收电磁波能量而转化为热能的能力。将活性组分AS2O3溶液用浸渍法加到载体纳米级锰锌铁氧体粉末上，由于作为载体的Mn0.5Zn0.5Fe2O4比表面极大，吸附性能优良，能使被吸附的药物与载体周围的药物之间始终保持着一种动态平衡，当游离的药物被体液稀释或被机体代谢浓度下降时，根据吸附等温曲线的平衡曲线，制剂马上释放等量的药物来补足被消耗的量，可以控制药物的缓慢释放，这不但提高了药物疗效，还可以使靶区以外的A. 阴性对照组 B. 化疗组C. 热疗组 D. 热化疗组图5 各实验组流式细胞分析结果
Fig 5 The results of flow cytometry
砷浓度大大降低，从而减轻了药物对正常组织的毒副作用。另外复合纳米粒的体外升温实验表明，复合纳米粒在交变磁场中具有良好的升温控温能力，不同浓度的复合纳米粒在交变磁场中升温控温的能力有所差别，实验结果表明浓度为10 g·L-1的材料在交变磁场中能升温至肿瘤治疗的恰当温度45 ℃且保持温度不变，可发挥既杀死肿瘤细胞而又不损失正常细胞的作用。实验中我们分为阴性对照组、化疗组、热疗组及热化疗组，MTT比色法检测结果显示As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料联合交变磁场热疗组对于人乳腺癌细胞具有强烈的细胞毒性，此组的细胞生存率明显低于化疗组和热疗组。流式细胞分析亦显示， As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米材料联合交变磁场热疗诱导的细胞凋亡率较相应同等浓度的单纯As2O3液及单纯磁性材料热疗组的细胞凋亡率要高，前者为 31.18%，而后两者分别为 7.44%、16.17%。
本实验成功制备了直径为20～40 nm、升温能达到肿瘤治疗有效温度同时可控缓慢释放药物的As2O3/Mn0.5Zn0.5Fe2O4复合纳米粒，合成工艺简单、易行，成本低廉.通过体外细胞实验证实，该纳米粒联合交变磁场热疗对肿瘤细胞具有很强的生长抑制和凋亡诱导作用，为治疗乳腺癌提供了新的思路。
参考文献
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