利用CEA694702β2m融合蛋白制备HLACEA694702复合体

　　　　 作者：孟凡岩，沈传来，郭薇，缪凤琴，谢维，张建琼

【摘要】 目的： 获得大量CEA694702β2微球蛋白(β2m)融合蛋白，并制备HLACEA694702复合体。方法： 通过引物设计在β2m基因的5′端引入CEA694702序列和Linker序列，并将目的基因克隆到质粒pET28a中，在BL21(DE3)中表达。CEA694702β2m和HLA重链蛋白用金属螯合亲和层析法进行纯化，并经稀释复性法复性。制备的HLACEA694702复合体用PEG20000浓缩，应用ELISA鉴定其构象，并用尺寸排阻色谱纯化和鉴定。结果： HLA重链蛋白和CEA694702β2m蛋白经金属螯合亲和层析法纯化后纯度提高。ELISA鉴定结果表明稀释复性后HLACEA694702复合体形成了正确的构象。利用尺寸排阻色谱对HLACEA694702复合体成功地进行了纯化。结论： 利用CEA694702β2m融合蛋白成功制备出HLACEA694702复合体，为HLACEA694702四聚体的制备奠定了基础。

【关键词】 β2微球蛋白; 癌胚抗原; 稀释复性法; HLA肽复合体

癌胚抗原(carcinoembryonic antigen， CEA)是一种相对分子质量为180 000～200 000的多糖蛋白复合物，属于免疫球蛋白超家族分子，介导细胞黏附功能，也是重要的肿瘤标志物之一，在结直肠癌、肺癌、胰腺癌、胃癌、乳腺癌、肝癌及其它恶性肿瘤患者的血清中有不同程度的高表达[1]。抗原肽CEA694702由9个氨基酸组成，为HLAA*0201限制性的短肽[2]，目前对此抗原肽特异性T细胞的数量和功能研究较少[3]。本研究采用CEA694702和β2微球蛋白(β2microglobulin，β2m)融合表达的策略构建CEA694702β2m融合蛋白，并和HLA重链(heavy chain， HC)复性成HLACEA694702复合体分子，为制备HLACEA694702四聚体，进一步用于抗肿瘤免疫的研究奠定基础。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　pET28a质粒、大肠杆菌DH5α、BL21(DE3)为本实验室保存;限制性内切酶、T4连接酶及高保真 DNA聚合酶均为TaKaRa公司产品，Western blot显影底物及BCA蛋白定量试剂盒均为Pierce公司产品，鼠抗人β2m单克隆抗体为Santa Cruz公司产品，W6/32抗体由美国Dr.Ferrone惠赠，HRP标记的羊抗鼠IgG抗体为Sigma公司产品;NiNTA为QIAGEN公司产品，Superdex 75 prep grade为Amersham Biosciences AB公司产品。

　　1.2 方法

　　1.2.1 CEA694702β2m重组质粒的构建和鉴定 以我们构建的pET28aβ2m重组质粒[4]为模板用两轮PCR的方法扩增出CEA694702β2m融合基因。第1轮所用上游引物为5′GGAGGTGGTGGTGGCGGATCAGGAGGCTCAGGAG

　　GTTCAGGAGGCATCCAGCGTACTCCAAAGATT3′，下游引物为5′CAACTCGAGCATGTCTCGATCCCACTTA

　　AC3′，下划线标示为Xho Ⅰ酶切位点。第2轮所用上游引物为5′GGCCCATGGGCGTACTAGTAGGCGTAGC

　　CCTAATCGGAGGTGGTGGTGGCGGA3′，下划线标示为Nco Ⅰ酶切位点，下游引物同第1轮。

　　质粒载体pET28a和PCR产物分别用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ酶切，连接后转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞。将转化后的DH5α涂布于含硫酸卡那霉素的LB培养基平板，置37 ℃ 培养过夜。挑取克隆并在LB液体培养基中培养，然后抽提质粒。重组质粒用Nco Ⅰ和Xho Ⅰ双酶切结合测序进行鉴定。

　　1.2.2 CEA694702β2m和HC包涵体蛋白的制备 将鉴定正确的重组质粒pET28aCEA694702β2m转化入BL21(DE3)中。挑取克隆，37 ℃培养至OD600 nm值为 0.6～0.8时，加入0.1 mmol·L-1 IPTG后于37 ℃诱导3 h。离心收集菌体，用Buffer A(50 mmol·L-1 Na3PO4、300 mmol·L-1 NaCl，pH7.0)重悬，超声破菌后用Buffer B(50 mmol·L-1 Na3PO4、300 mmol·L-1 NaCl、0.6 mmol·L-1脱氧胆酸钠、1% Triton X100，pH7.0)洗涤包涵体沉淀。最后沉淀重悬于Buffer C(100 mmol·L-1 Nah3PO4、10 mmol·L-1 Tris、8 mol·L-1 urea，pH8.0)中，室温轻缓搅拌，直至沉淀溶解。离心收集上清，分装后置-70 ℃保存备用。含pET28aHC重组质粒的BL21(DE3)菌为以前实验室所备[5]，HC包涵体的制备过程同上。

　　1.2.3 Western blot鉴定CEA694702β2m蛋白 制备的CEA694702β2m包涵体蛋白用Western blot鉴定其表达是否正确，方法是：CEA694702β2m蛋白经SDSPAGE后转移至PVDF膜上，加入3% BSAPBS封闭液，4 ℃封闭过夜。将封闭液倒掉，加入鼠抗人β2m单抗于室温孵育1 h。洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，室温孵育1 h。洗涤后在膜上滴加DAB显色。

　　1.2.4 HC和CEA694702β2m蛋白的亲和纯化 利用金属螯合亲和层析(immobilized metal ion affinity chromatography， IMAC)纯化HC和CEA694702β2m蛋白，方法是：分别将HC和CEA694702β2m蛋白与2 ml NiNTA在室温混合30 min，然后装入空色谱柱中，用Buffer C洗至吸光度稳定。然后分别用Buffer D、E和F洗脱蛋白，其中Buffer D、E和F成分同Buffer C，pH分别为6.3、5.9和4.5。收集各洗脱成分并进行电泳。

　　1.2.5 HLACEA694702复合体的制备 将纯化后的HC(3 μmol·L-1)和CEA694-702β2m(6 μmol·L-1)分3次加入到100 ml复性缓冲液(100 mmol·L-1 Tris、2 mmol·L-1 EDTA、400 mmol·L-1 L精氨酸、5 mmol·L-1还原型谷胱甘肽、0.5 mmol·L-1氧化型谷胱甘肽和0.2 mmol·L-1 PMSF)中，于10 ℃搅拌48～72 h进行复性。复性后经PEG 20000浓缩，用Buffer G(20 mmol·L-1 Tris、150 mmol·L-1 NaCl，pH8.0)进行透析。

　　1.2.6 ELISA鉴定HLACEA694702复合体的构象 浓缩并透析的复性蛋白进行SDSPAGE，用软件根据灰度值计算HC和CEA694702β2m蛋白的比例，然后用ELISA鉴定HLACEA694702复合体的构象，方法是：将复性蛋白和对照(未复性的HC和CEA694702β2m蛋白，其比例同复性蛋白)包被在96孔酶标板中，用含2% BSA的PBS于4 ℃封闭2 h。加入W6/32于4 ℃孵育2 h，洗涤后加入HRP标记的羊抗鼠IgG抗体，4 ℃孵育2 h。洗涤后加入底物A液和B液显色后用2 mol·L-1 h3SO4终止，最后用酶标仪于495 nm处读取OD值。

　　1.2.7 尺寸排阻色谱纯化并鉴定HLACEA694702复合体 尺寸排阻色谱Superdex 75(柱长70 cm，柱内径1.0 cm)用Buffer G平衡，然后将浓缩并透析的蛋白样品加到色谱柱上端，用Buffer G洗脱，流速为0.3 ml·min-1，收集洗脱成分并进行电泳。

　　2 结 果

　　2.1 CEA694702β2m重组质粒的构建和鉴定

　　如图1A所示，CEA694702β2m基因从N端到C端依次包含有：抗原肽CEA694702序列、Linker序列、β2m基因和Histag序列，全长396 bp。pET28aCEA694702β2m重组质粒构建后经Xho Ⅰ和Nco Ⅰ双酶切后显示出预期长度的目的基因条带和载体DNA条带，说明目的基因被正确地插入质粒载体中(图1B);经测序分析，目的基因的序列与设计的序列完全一致。

　　将测序正确的重组质粒pET28aCEA694702β2m转化入BL21(DE3)中，经IPTG诱导后发现CEA694702β2m主要以包涵体的形式表达。SDSPAGE显示经提取和初步纯化后包涵体蛋白的条带位置与其相对分子质量(14 700)相符。Western blot结果表明，表达蛋白可以与抗人β2m的单克隆抗体结合，说明CEA694702β2m表达正确(图2)。

　　2.3 HC和CEA694702β2m融合蛋白的纯化

　　HLA重链蛋白HC和CEA694702β2m融合蛋白都带有Histag，所以可以用IMAC进行纯化。如图3所示，当溶液pH为4.5时洗脱出来的蛋白最多。据光密度扫描分析，纯化前的HC和CEA694702β2m的纯度分别约为72%和77%，纯化后这两种蛋白的纯度分别约为92%和86%。在单体CEA694702β2m融合蛋白(14 700)的上方有一条带，大小约为29 000，经IMAC纯化后仍存在，能被抗人β2m单抗结合(数据未展示)，推测其为CEA694702β2m的二聚体，这可能是由Loading buffer中的β巯基乙醇还原能力下降引起的。CEA694702β2m的纯度计算包括此条带在内。

　　W6/32是一种针对HLA Ⅰ类分子构象的特异性单抗。将稀释复性法制备的HLACEA694702复合体，以及未复性的HLA重链和CEA694702β2m分别在ELISA实验中用W6/32检测，结果显示HLACEA694702复合体能与W6/32特异性结合，其OD值高于游离重链和CEA694702β2m对照组的OD值(图4)。

　　2.5 HLACEA694702复合体的纯化及鉴定

　　HLACEA694702复合体用尺寸排阻色谱Superdex 75进行纯化，得到3个蛋白洗脱峰(图5)。SDSPAGE显示，第1个洗脱峰中含有HC和CEA694702β2m蛋白，为MHCCEA694702复合体峰;第2个洗脱峰为CEA694702β2m蛋白;第3个洗脱峰没有蛋白，可能是溶液中其它成分，如EDTA等。

　　3 讨 论

　　HLA Ⅰ类分子由HC、β2m和抗原肽三部分组成。为了减少合成抗原肽的步骤并增加HLA肽复合体的稳定性，Uger等[6]建立了肽和β2m融合表达的方法，即肽和β2m利用一段8～15个氨基酸组成的Linker连接起来形成肽β2m融合蛋白。这种方法的优点是不用合成抗原肽，肽β2m融合蛋白可以在细菌中大量表达，构建成的MHC肽复合体分子产量高且更加稳定。实验表明，利用肽β2m融合蛋白和MHC重链蛋白复性成的MHC肽复合体分子，已成功地应用于抗原特异性T细胞的刺激增殖以及抗原特异性T细胞的检测[610]。我们以前的实验表明，MART12735β2m融合蛋白可以在宿主菌BL21中大量表达，并可以和HC结合复性成稳定的HLAMART12735复合体[11]。我们将CEA694702和β2m融合表达，同样制备出结构和构象正确的HLACEA694702复合体。

　　本实验选取质粒pET28a为CEA694702β2m的表达载体，一是因为pET28a质粒在我们以前的实验中可以大量表达我们的目的蛋白，包括HLA HC和β2m等;二是因为利用此质粒可以很方便地在目的蛋白羧基端加上6个组氨酸组成的Histag，能通过IMAC进行纯化，而蛋白纯度的提高有利于随后的复性[12];同时，Histag分子量很小，不会影响后继的复性过程。

　　CEA694702(GVLVGVALI)是从结肠癌细胞系SW1116和新鲜结肠癌组织中鉴定出来的CEA的一个T细胞表位[2]。有研究者[3]的实验表明，CEA694702与HLAA2分子的亲和力以及其免疫原性均较弱。目前对该段抗原肽研究仍较少，而HLACEA694702复合体的制备为进一步研究CEA694702特异性T细胞提供了方便。

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