爆炸伤创面骨骼肌细胞凋亡的研究

【摘要】 目的： 研究兔肢体爆炸伤创面骨骼肌细胞凋亡、白细胞介素6(IL6)和α肿瘤坏死因子(TNFα)的表达。方法： 新西兰大白兔30只，随机分为炸伤后即刻取材组和炸伤创面普通纱布包扎放置1、3、6、12h后取材组(n=6);0.9g铜壳单质猛黑索金炸药(RDX)爆炸装药，海绵间隔4.5cm，绑于左下肢股部中段前外侧，电引爆;分别取爆炸中心区(Ⅰ区)、边缘区(Ⅱ区)、爆震区(Ⅲ区)炸伤肌肉组织，经原位缺口末端标记法作肌肉组织细胞凋亡检测，ELISA法测定肌肉组织的IL6、TNFα含量，并与正常肌肉组织对照研究。结果与结论： 爆炸伤后12h内Ⅰ区偶尔或未检测到凋亡细胞，与正常组织间差异无统计学意义(P&>0.05)。Ⅱ区和Ⅲ区肌肉组织在伤后3h出现凋亡细胞，6h达到高峰，与正常组织间差异有显著意义(P&<0.01);之后逐渐减少，各检测时间点凋亡细胞数Ⅱ区均高于Ⅲ区，差异有显著意义(P&<0.01)。炸伤各区组织IL6、TNFα含量均高于正常组织含量，差异有显著意义(P&<0.01);自Ⅰ、Ⅱ区到Ⅲ区，含量依次降低，差异显著 (P&<0.01)。Ⅱ区和Ⅲ区中IL6含量在伤后3h高表达，6h达高峰，之后逐渐下降，其变化规律与细胞凋亡情况相似;TNFα含量在伤后3h达到高峰，之后逐渐下降。

【关键词】 爆炸伤; 创面; 细胞凋亡; 白细胞介素6; 肿瘤坏死因子α;　兔

高爆性武器损伤是一种集破片伤、冲击伤、烧伤多种损伤于一体的复合性损伤，几种致伤因素共同作用使爆炸伤创面呈现复杂的病理变化。现代战争中，肢体爆炸伤占有相当大的比例。为此，制作一种新型的接近实战的兔肢体爆炸伤模型，观察炸伤后创面肌肉组织细胞凋亡的情况，且对炸伤组织中细胞因子白细胞介素6(IL6)和α肿瘤坏死因子(TNFα)作相应测定，以增加对爆炸伤的理性认识。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物及分组

　　健康新西兰大白兔30只，体重2.5～3.5kg，雌雄不限。随机分为伤后即刻取材组(n=6)和炸伤创面普通纱布包扎放置1、3、6、12h后取材组(n=6)，并与对侧肢体相应部位组织作自身对照研究。

　　1.2 爆炸伤模型制作

　　实验兔常规肌肉注射安定1mg·kg-1，腹腔注射氯胺酮4mg·kg-1，剪毛备皮、分组实验。两上肢固定于实验台上，左下肢股部中段前外侧绑以0.9g单质猛炸药黑索金(RDX)铜壳小型爆炸装置;炸药与肢体间以4.5cm厚海绵间隔;双下肢不固定，避免爆炸引起兔强烈抽动，造成肢体骨折;腹部及对侧肢体以隔板保护(图1、2);电引爆[1]。图1 兔固定于实验台，隔板保护，测量爆炸装药与肢体距离

　　图2 爆炸造成肢体皮肤创面近似圆形，创缘不齐，

　　创面周围皮肤点状破损及燎毛现象

　　1.3 组织取材与处理

　　爆炸创面使用精确度0.002mm的游标卡尺测量，创面半径内1/2区域为爆炸中心区(Ⅰ区)，半径外1/2区域为爆炸边缘区(Ⅱ区)，爆炸创面以外与爆炸创面半径的1/2同样宽度为爆震区(Ⅲ区)。各组分别于伤后即刻和伤后1、3、6、12h，自Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区及对侧肢体相应部位切取肌肉组织，1/2标本放置于4%多聚甲醛中固定，以备细胞凋亡检测;其余部分标本用锡纸包裹置于液氮中冷藏，待测定IL6、TNFα。

　　1.4 免疫组化染色

　　肌组织标本石蜡包埋，连续切片，厚4μm，作末端转移酶标记法(TUNEL)染色。TUNEL试剂盒由北京中山生物技术有限公司提供，按照试剂盒说明书操作。光镜观察组织切片，细胞核棕褐色者为阳性细胞，即凋亡细胞。选每张阳性切片中凋亡细胞最多的高倍视野5个，计数阳性细胞数，其均值作为平均凋亡细胞数，对视野周边部“压边”的细胞，计左不计右，计上不计下。荧光显微镜观察，细胞核中有荧光颗粒者为凋亡细胞。

　　1.5 创面肌肉组织中IL6和TNFα含量测定

　　冷藏标本实验室解冻并经蒸馏水洗涤后，置自动匀浆机匀浆，离心机离心取上清液，采用ELISA方法进行检测。IL6和TNFα试剂盒由Biowen， Ltd Canada提供，按照试剂盒说明书操作，单位分别为pg·ml-1、ng·ml-1。

　　1.6 统计学处理

　　各组数据用均数加减标准差(x±s)表示，所有数据均用SPSS 16.0软件进行统计学分析，成对资料用t检验进行分析，组间比较作方差分析，P&<0.05为差异有统计学意义。

　　2 结 果

　　2.1 大体形态观测

　　爆炸后30只兔均造成左下侧肢体股外侧开放性伤，伤口大小(3.12±0.45)cm×(3.65±0.52)cm，创面不规则，出血，创面组织撕裂、离断，部分烧灼伤，部分兔发生骨折，30只兔无死亡。

　　2.2 免疫组化法检测组织细胞凋亡

　　光镜观察，Ⅰ区和正常肌肉组织在伤后12h内偶尔或未检测到凋亡细胞(图3)。与正常肌肉组织相比，Ⅱ区和Ⅲ区组织在伤后3h时检测到凋亡细胞(P&<0.01)，细胞核着色为棕褐色，胞膜皱缩、不规则，细胞核分裂、贴边，胞浆红染;伤后6h时凋亡细胞数达到高峰(图4、5)，之后逐渐下降。荧光显微镜观察，Ⅱ区和Ⅲ区在伤后3h检测到凋亡细胞(图6、7)，其胞核中有黄绿色荧光颗粒。伤后0h和1h，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区与正常组织间细胞凋亡差异无统计学意义(P&>0.05)，而伤后3、6和12h，Ⅰ区及正常组织间细胞凋亡差异无统计学意义(P&>0.05)，其余各组间细胞凋亡差异有极显著意义(P&<0.01)。见表1。表1 创面不同区域肌肉组织TUNEL凋亡阳性细胞数在同一时间点：与Ⅲ区比较，1)P&<0.01; 与Ⅱ区比较，2)P&<0.01; 与正常组织比较，3)P&<0.01。在同一区域：与第0小时比较，4)P&<0.01;与第1小时比较，5)P&<0.01;与第3小时比较，6)P&<0.01;与第6小时比较，7)P&<0.012.3 创面肌肉组织中IL6和TNFα含量测定

　　伤后12h内，IL6、TNFα含量变化在Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ区与正常组织比较有极显著意义(P&<0.01)。Ⅰ区和正常肌肉组织，IL6、TNFα含量变化在伤后12h内无统计学意义(P&>0.05)。Ⅱ区和Ⅲ区，IL6含量在伤后3h时开始升高(P&<0.01)，伤后6h达高峰，之后逐渐下降，12h时仍为较高水平表达，与伤后0、1h及正常组织差异显著(P&<0.01);TNFα含量在伤后3h达到高峰(P&<0.01)，之后逐渐下降。见表2、3。表2 伤后创面不同区域肌肉组织IL6的表达在同一时间点：与正常组织比较，1)P&<0.01;与Ⅲ区比较，2)P&<0.01; 与Ⅱ区比较，3)P&<0.01。在同一区域：与第0小时比较，4)P&<0.01;与第1小时比较，5)P&<0.01;与第3小时比较，6)P&<0.01;与第6小时比较，7)P&<0.01表3 伤后创面不同区域肌肉组织TNFα的表达在同一时间点：与正常组织比较，1)P&<0.01;与Ⅲ区比较，2)P&<0.01; 与Ⅱ区比较，3)P&<0.01。在同一区域：与第0小时比较，4)P&<0.01;与第1小时比较，5)P&<0.01;与第3小时比较，6)P&<0.01;与第6小时比较，7)P&<0.01

　　3 讨 论

　　近年来对于爆炸伤有一些研究，但对爆炸伤创面组织的研究较少，有学者[2]对爆炸伤创面组织的细胞因子表达进行过相关研究，对于创面组织细胞凋亡的研究未见报道，为此本实验做了初步研究。

　　细胞凋亡是细胞在生理和病理情况下的一种死亡模式，此概念由美国病理学家Kerr等[3]在1972年首先提出，指细胞受到一些特殊信号刺激后，按照内在程序，即细胞预存的死亡程序，由其自身内部机制调控的主动的细胞死亡，属于机体自身的生理活动，又称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)。其典型的形态学特征主要表现为细胞膜皱缩，胞浆浓缩，核固缩，染色质边集和破裂，凋亡小体形成。细胞凋亡的检测方法很多，荧光显微镜观察法可以判断有无细胞凋亡的发生;近年来发展的TUNEL已被应用到组织中细胞的凋亡研究[4]，通过原位检测组织中细胞凋亡具有很多优点，它能直接地特异性地标记细胞核中断裂的DNA。另外，研究[5]证明TUNEL灵敏度特异性都较高，尤其对早期凋亡细胞的检出更为适用。

　　本实验研究基于目标接受爆炸物爆轰作用，形成创面的不同区域承受能量不一致而划分Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ区。研究表明，爆炸伤创面Ⅱ区和Ⅲ区肌肉组织伤后3h出现凋亡细胞，6h细胞凋亡到达高峰，这可能与该区域相对创面中心区距离爆心较远，吸收能量少，组织毁损较轻，仍然存在一定血液供应，但较正常肌组织相对缺血缺氧有关。缺血缺氧导致ATP合成减少，线粒体功能紊乱，线粒体通透性转换孔的开放，细胞色素c和凋亡诱导因子被大量释放，从而引起骨骼肌细胞凋亡[6]。有研究表明骨骼肌缺血2h并没有凋亡细胞出现，但更长时限的缺血与骨骼肌凋亡关系的研究尚未有报道[7]。Ⅰ区肌肉组织在伤后12h内偶尔或未见到凋亡细胞，可能是因为Ⅰ区距离爆心最近，组织毁损最重，局部肌肉组织出现坏死。实验也表明在细胞凋亡出现的同一时间点，Ⅱ区组织凋亡细胞数比Ⅲ区更多，这可能由于Ⅱ区距爆心较近，组织细胞损伤比Ⅲ区重的缘故。

　　IL6是敏感反映机体炎症和组织损伤严重程度的重要指标[8];TNFα是介导多向性炎症和炎症的启动因子，使IL6等因子的合成和分泌增多、扩大级联反应和其生物效应。在本实验中，IL6和TNFα含量在爆炸创面各区都有明显的高表达，肢体爆炸伤的伤情与创面到爆心的距离密切相关。炸伤创面Ⅰ区距爆心最近，组织创伤最重，IL6和TNFα含量表达最高;Ⅲ区距爆心最远，组织损伤最轻，IL6和TNFα含量表达低。致伤1h后IL6和TNFα含量有所升高，但差异不显著，主要是由“全身细胞因子池”[9]中游离出来随细胞变性坏死进入细胞基质并在损伤区域聚集，且持续从“全身细胞因子池”中游出的炎症因子在创伤区域聚集，使之继续升高，TNFα含量在3h达到高峰，IL6含量在伤后6h达高峰。这与TNFα属于炎症启动因子，促进IL6的合成和分泌有关。

　　综上所述，Ⅰ区肌肉组织在短期内无凋亡细胞出现，Ⅱ区和Ⅲ区在伤后3h出现凋亡细胞，且出现时间与组织中IL6、TNFα含量升高的时间较一致，凋亡细胞数到达高峰的时间也与IL6含量达到最高的时间相一致，说明IL6、TNFα对细胞凋亡过程可能起一定作用。有报道[10]，创伤后肌细胞线粒体损伤，TNFα释放，通过激活caspase9促进肌细胞的凋亡。Zhang等[11]在研究中发现IL6可以促进肌细胞凋亡。本实验研究了在爆炸伤后早期创面不同区域细胞凋亡的表达，但在更长时间窗细胞凋亡的变化规律及爆炸伤后出现凋亡细胞的作用机制尚待进一步研究。

参考文献

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